Aβ1 | Chuzhou Research Chemical Inc.

Molekulare Psychiatrie (2023)Diesen Artikel zitieren

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Die Alzheimer-Krankheit (AD), die häufigste Ursache für Demenz bei älteren Erwachsenen, ist eine doppelte Proteinopathie, die durch Amyloid-β (Aβ) und Tau-Pathologie gekennzeichnet ist. Trotz enormer Anstrengungen, die in den letzten Jahrzehnten unternommen wurden, um wirksame Therapien zu finden, haben späte pharmakologische Interventionen im Krankheitsverlauf, ungenaue klinische Methoden bei der Patientenaufnahme und unzureichende Biomarker zur Bewertung der Arzneimittelwirksamkeit die Entwicklung einer wirksamen Therapie nicht ermöglicht therapeutische Strategie. Die bisher verfolgten Ansätze zur Entwicklung von Arzneimitteln oder Antikörpern konzentrierten sich ausschließlich auf die gezielte Bekämpfung von Aβ oder Tau-Protein. In diesem Artikel wird die potenzielle therapeutische Kapazität eines synthetischen All-D-Isomer-Peptids untersucht, das auf die ersten sechs Aminosäuren der N-terminalen Sequenz des A2V-mutierten Aβ, Aβ1-6A2V(D), beschränkt ist und nach der Beobachtung von entwickelt wurde ein klinischer Fall, der den Hintergrund für seine Entwicklung lieferte. Wir führten zunächst eine eingehende biochemische Charakterisierung durch, um die Fähigkeit von Aβ1-6A2V(D) zu dokumentieren, die Aggregation und Stabilität des Tau-Proteins zu stören. Um die in vivo-Wirkung von Aβ1-6A2V(D) gegen einen neurologischen Rückgang bei genetisch prädisponierten oder erworbenen Mäusen mit hohem AD-Risiko zu bekämpfen, haben wir seine Wirkung an dreifach transgenen Tieren getestet, die menschliches PS1(M146 V), APP(SW) und MAPT(P301L) beherbergen ) Transgene und gealterte Wildtyp-Mäuse, die einer experimentellen traumatischen Hirnverletzung (SHT) ausgesetzt waren, einem anerkannten Risikofaktor für AD. Wir fanden heraus, dass die Behandlung mit Aβ1-6A2V(D) bei TBI-Mäusen die neurologischen Ergebnisse verbesserte und die Blutmarker für axonale Schäden reduzierte. Indem wir das C. elegans-Modell als Biosensor für die Toxizität amyloidogener Proteine nutzten, beobachteten wir im Vergleich zu TBI-Kontrollen eine Rettung von Bewegungsdefekten bei Nematoden, die den Gehirnhomogenaten von mit Aβ1-6A2V(D) behandelten TBI-Mäusen ausgesetzt waren. Durch diesen integrierten Ansatz zeigen wir, dass Aβ1-6A2V(D) nicht nur die Tau-Aggregation behindert, sondern auch deren Abbau durch Gewebeproteasen begünstigt, was bestätigt, dass dieses Peptid sowohl die Aβ- als auch die Tau-Aggregationsneigung und Proteotoxizität beeinträchtigt.

Die Alzheimer-Krankheit (AD) ist eine doppelte Proteinopathie, die durch Amyloid-β (Aβ) und Tau-Pathologie gekennzeichnet ist und die häufigste Demenz bei älteren Erwachsenen ist [1, 2]. Trotz enormer Anstrengungen, die in den letzten Jahrzehnten unternommen wurden, um eine wirksame Therapie zu finden, stehen immer noch wenige Waffen zur Bekämpfung dieser Krankheit zur Verfügung. Kürzlich wurde Lecanemab, ein humanisierter monoklonaler Antikörper, der mit hoher Affinität an Aβ-lösliche Protofibrillen bindet, von der US-amerikanischen Food and Drug Administration zur Behandlung von AD-Patienten mit leichter kognitiver Beeinträchtigung oder leichter Demenz zugelassen [3]. Seit der Zulassung von Aducanumab [4] ist dies der zweite für diese Krankheit zugelassene Antikörper. Die mit der Verwendung dieser Medikamentenklasse verbundenen Vorteile müssen noch ermittelt werden. Sie sind sehr teuer und erfordern eine kontinuierliche Überwachung der Patienten, was einen erheblichen Ressourcenaufwand für das Gesundheitssystem bedeutet. Darüber hinaus gibt es immer noch große Debatten über die Fähigkeit dieser Antikörper, insbesondere Aducanumab, kleine Hirnblutungen und Amyloid-bedingte Bildstörungen im Zusammenhang mit Hirnödemen und neurologischen Störungen auszulösen [5]. Es ist daher klar, dass AD immer noch eine unheilbare Krankheit ist [6]. Die Gründe für das anhaltende Scheitern von mehr als 400 pharmakologischen Studien zur Alzheimer-Krankheit sind unklar und sicherlich nicht einfach zu klären. Verschiedene Faktoren können zu ihrem Scheitern beigetragen haben, darunter späte therapeutische Interventionen im Krankheitsverlauf, ungenaue klinische Methoden bei der Patientenaufnahme und unzureichende Biomarker zur Bewertung der Arzneimittelwirksamkeit [6,7,8,9,10,11].

Eine der größten Einschränkungen der bisher bei der Behandlung von AD verwendeten Ansätze ist die Entwicklung mutmaßlicher modifizierender Medikamente, die nur auf Aβ abzielen, nicht auf Tau, das ebenfalls aktiv am Ausbruch und Fortschreiten von AD beteiligt ist [1, 2]. Obwohl seit langem bekannt ist, dass Tau-Spezies im Krankheitszustand von Zelle zu Zelle wandern und die neurodegenerative Pathologie verbreiten können, wurde dieses Protein erst kürzlich als medikamentöses Ziel angesehen [12, 13]. In den letzten 15 Jahren wurden verschiedene Therapieansätze gegen pathologische Tau-Formen entwickelt und getestet, hauptsächlich Tau-Aggregationsinhibitoren und monoklonale Anti-Tau-Antikörper [10]. Einige erwiesen sich als wirksam, wenn sie in vitro und in vivo in AD-Tiermodellen getestet wurden [13]. Gegenüber Aβ-Targeting-Verbindungen zeigten sie jedoch keine klinische Wirksamkeit. Die gezielte Konzentration auf ein einzelnes Protein ist keine erfolgreiche Strategie zur Bekämpfung einer komplexen Krankheit wie AD. Die Entwicklung einer Multitarget-Therapie, die sowohl gegen Aβ als auch gegen Tau wirken kann, könnte einen innovativen pharmakologischen Ansatz darstellen.

Wir haben kürzlich eine neuartige, bioinspirierte AD-Strategie vorgeschlagen, die auf der klinischen Entdeckung basiert, dass das Vorhandensein der A2V-Substitution in der N-terminalen Domäne von Aβ selbst eine schützende Rolle bei der Amyloidogenese spielt, indem sie die Geschwindigkeit des Proteinaufbaus und die Aggregationskinetik beeinflusst [14,15,16]. Auf dieser Grundlage haben wir den Entwurf eines synthetischen All-D-Isomer-Peptids vorgeschlagen, das auf die ersten sechs Aminosäuren der N-terminalen Sequenz des A2V-mutierten Aβ, Aβ1-6A2V(D) beschränkt ist [17]. Dieses kurze Peptid interagiert mit Aβ-Wildtyp in voller Länge und stört die Oligomerbildung, Fibrillenbildung und Amyloidakkumulation [18, 19]. Es beeinträchtigt auch die Aβ-abhängige Neurotoxizität und synaptische Dysfunktion in Tiermodellen und kehrt die durch Aβ induzierte In-vitro- und In-vivo-Synaptopathie um [16, 20, 21, 22]. Darüber hinaus zeigten von unserer Gruppe und anderen unabhängigen Wissenschaftlern durchgeführte Molekulardynamiksimulationen, dass die antiamyloidogene Aktivität des Aβ1-6A2V(D)-Peptids mit seiner strukturellen Flexibilität zusammenhängt, die die heterotypische Wechselwirkung mit Aβ erleichtert und dessen Zusammenbau behindert [15]. , 23, 24].

Wir stellten die Hypothese auf, dass die durch die A2V-Substitution ausgeübte natürliche Schutzwirkung gegen AD nicht nur auf die Wechselwirkung mit Aβ beschränkt ist, sondern auch Auswirkungen auf Tau beinhalten könnte. Dementsprechend könnte die In-vivo-Wirksamkeit des bioinspirierten Aβ1-6A2V(D)-Peptids gegen AD auf zusätzliche Nicht-Aβ-Effekte zurückzuführen sein, die mit Tau-Targeting verbunden sind.

Um unsere Arbeitshypothese zu testen, haben wir in dieser Studie zunächst die Fähigkeit des Hexapeptids zur Aggregation und Stabilität von rekombinantem Tau bewertet. Um die Wirkung von Aβ1-6A2V(D) auf die Tau-Toxizität zu untersuchen, verwendeten wir Caenorhabditis elegans als Biosensor [25,26,27]. Dieser Fadenwurm ist in der Lage, toxische Tau-Anordnungen, insbesondere oligomere Anordnungen, spezifisch zu erkennen, selbst wenn er exogen verabreicht wird, was zu einer neuromuskulären Beeinträchtigung führt. Durch die Verabreichung von Gehirnhomogenaten von transgenen P301L-Mäusen, einem gut charakterisierten Tiermodell der Tauopathie, an C. elegans konnten wir einen neuronalen Defekt nachweisen, der mit dem bei oligomerem rekombinantem Tau beobachteten übereinstimmt [27]. Dieser gut validierte Ansatz stellt ein nützliches Instrument für das Screening potenzieller pharmakologischer Wirkstoffe dar [27]. Um die Relevanz der Aβ1-6A2V(D)-Behandlung bei AD und anderen Demenzen mit Tau-Pathologie zu testen, verwendeten wir unser etabliertes präklinisches Modell für traumatische Hirnverletzungen (TBI) [28, 29]. Beim Menschen löst TBI eine Tau-Pathologie mit einem Isoformenprofil und einem Phosphorylierungszustand ähnlich wie bei AD aus [30]. Wir haben zuvor gezeigt, dass bei TBI, wie bei AD und anderen Tauopathien, abnormale Formen von Tau mit Prion-ähnlichen Eigenschaften entstehen und zur späten Neurodegeneration und zum kognitiven Verfall beitragen [28]. Wir haben auch gezeigt, dass die Exposition von Würmern gegenüber Gehirnhomogenaten von TBI-Mäusen zu einer fortschreitenden Funktionsstörung des Bewegungsapparats mit neuromuskulären Schäden und einer Beeinträchtigung der postsynaptischen Neurotransmission führte [26]. Wichtig ist, dass die Verabreichung von Anti-Tau-Antikörpern motorische Defizite rettete [26]. Dies weist auf die kausale Rolle von fehlgefaltetem/aggregiertem TBI-generiertem Tau bei der Toxizität hin und unterstützt die Nematoden- und unsere TBI-Mausmodelle für die Bewertung von Aβ1-6A2V(D) als neuartiges Therapeutikum bei erworbenen Formen von AD.

Ein erhöhtes Risiko für viele neurodegenerative Erkrankungen, einschließlich AD, ist seit langem nach einer SHT-Exposition bekannt, wobei schätzungsweise 5–10 % der Demenzerkrankungen in der Bevölkerung als TBI-assoziiert gelten [31,32,33]. Daher ist SHT ein führender Risikofaktor für neurodegenerative Erkrankungen. Wichtig ist, dass die Neurodegeneration nach TBI eine einzigartige Gelegenheit bietet, den zeitlichen Verlauf und die Ursachen der Demenzpathologie von einem bestimmten Zeitpunkt aus zu untersuchen. Wir glauben, dass unser Ansatz Informationen über die therapeutischen Eigenschaften von Aβ1-6A2V(D) nicht nur bei AD, sondern auch bei anderen Tauopathien wie TBI-induzierter Neurodegeneration und damit verbundener Demenz liefern wird.

Aβ1-6A2V(D) (DVEFRH), TAT48-56(D) (GRKKRRQRRR) und Aβ1-6A2V(D)-TAT (DVEFRH-GGGG-GRKKRRQRRR) wurden durch Festphasenpeptidsynthese auf einem automatisierten Alstra-Synthesizer synthetisiert ( Biotage, Uppsala, Schweden) im 0,1 mM-Maßstab mit NOVASYN-TGA-Harz (Novabiochem, Darmstadt, Deutschland) unter Verwendung von Fmoc-geschützten D-Aminosäuren (Sigma Aldrich, Laufelfingen, CH) [16]. Aminosäuren wurden durch eine Reaktion mit O-(Benzotriazol-1-yl)-N, N, N', N'-Tetramethyluroniumtetrafluorborat und N, N-Diisopropylethylamin aktiviert. Nach dem letzten Kopplungszyklus jeder Aminosäure war ein Capping-Schritt mit Essigsäureanhydrid enthalten. Das Peptid wurde mit Trifluoressigsäure/Thioanisol/Wasser/Phenol/Ethandithiol (82,5:5:5:5:2,5 Vol./Vol.) vom Harz abgespalten, ausgefällt und mit Diethylether gewaschen. Die Peptide wurden durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie auf einer semipräparativen C18-Säule (Waters Corporation, Milford, MA) gereinigt und ihre Identität mit einem MALDI-TOF-Spektrometer (Applied Biosystems, Concord, Ontario, Kanada) bestätigt. . Anschließend wurden die Proben gefriergetrocknet und bis zur Verwendung bei –20 °C gelagert. Die Peptidreinheit lag über 95 %.

Männliche JNPL3-Mäuse, die menschliches 0N4R-Tau mit der P301L-Mutation (P301L) exprimieren, wurden von Taconic Biosciences (New York, USA) erhalten (Tau-Modell 2508). Die Kontrollen waren nicht-transgene (Non-tg) männliche Mäuse mit dem gleichen gemischten C57BL/6-, DBA/2- und SW-Genhintergrund wie P301L-Mäuse. Dreifach transgene Mäuse, die die Transgene PS1 (M146 V), APP (SW) und MAPT (P301L) tragen und als 3xTg-AD bezeichnet werden, wurden freundlicherweise von Dr. Oddo zur Verfügung gestellt [34]. Männliche und weibliche C57BL/6 J-Mäuse, die als Wildtyp (WT) bezeichnet werden, wurden von Envigo (Italien) gekauft.

Die Mäuse wurden in einem spezifischen pathogenfreien Tierraum bei einer konstanten Temperatur von 21 ± 1 °C, einer Luftfeuchtigkeit von 60 ± 5 %, einem 12-stündigen Hell-/Dunkelzyklus und ad libitum Zugang zu Futter und Wasser gehalten.

Verfahren mit Tieren und deren Pflege wurden in Übereinstimmung mit den institutionellen Richtlinien des Istituto di Ricerche Farmacologiche Mario Negri IRCCS in Übereinstimmung mit den nationalen (D.lgs 26/2014; Genehmigung Nr. 19/2008-A, ausgestellt am 6. März 2008, von) durchgeführt Gesundheitsministerium); Institutionelle Vorschriften und Richtlinien von Mario Negri zur internen Genehmigung von Personen, die Tierversuche durchführen (Zertifikat für das Qualitätsmanagementsystem – UNI EN ISO 9001:2015 – Reg. Nr. 6121); der NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Ausgabe 2011) und EU-Richtlinien und Leitlinien (EEC Council Directive 2010/63/UE). Die Tierhaltungseinrichtungen entsprechen internationalen Standards und werden regelmäßig von einem zertifizierten Tierarzt überprüft, der für die Gesundheitsüberwachung, Tierschutzüberwachung, Versuchsprotokolle und die Überprüfung der Verfahren verantwortlich ist.

Alle Tierversuche wurden gemäß den ARRIVE-Richtlinien [35] konzipiert, mit dem Ziel, die Anzahl der Mäuse zu verfeinern, zu reduzieren und zu ersetzen und gleichzeitig Biostatistiken zur Optimierung der Mäusezahlen zu verwenden, wie in unserer vorherigen Arbeit mit dem Maus-TBI-Modell [28, 36, 37]. Aus Gründen der statistischen Validität verwendeten wir daher 8 bis 10 Mäuse für die Verhaltenstests und 6 bis 10 Mäuse für Biomarker und biochemische Analysen.

Kurz gesagt, die kontrollierte kortikale Wirkung wurde über den linken parietotemporalen Kortex von 2 Monate alten 3xTg-AD-Mäusen oder alten (24 Monate alten) WT-Mäusen induziert. Mäuse wurden durch Isofluran-Inhalation (Einleitung 3 %; Erhaltung 1,5 %) in einer N2O/O2-Mischung (70 %/30 %) anästhesiert und in einen stereotaktischen Rahmen gebracht. Anschließend wurden die Mäuse einer Kraniektomie unterzogen, gefolgt von der Induktion einer kontrollierten kortikalen Hirnschädigung, wie zuvor beschrieben [36]. Kurz gesagt, die Verletzung wurde mithilfe eines starren 3-mm-Impaktors induziert, der von einem elektromagnetisch gesteuerten Schlaggerät (Impact OneTM; Leica, Buffalo Grove, IL, USA) angetrieben wurde, starr in einem Winkel von 20° zur vertikalen Ebene montiert und auf die exponierte Stelle aufgebracht wurde Dura mater, zwischen Bregma und Lambda, über dem linken parietotemporalen Kortex (Anterior-Posteriorität: –2,5 mm, Lateralität: –2,5 mm), bei einer Impaktorgeschwindigkeit von 5 m/s und einer Deformationstiefe von 2 mm, was zu einem schweren Ausmaß an Verletzung [38]. Anschließend wurde die Kraniotomie mit einer Kranioplastik abgedeckt und die Kopfhaut vernäht. Schein-Mäuse mit gleichem Alter erhielten die gleiche Anästhesie und Operation ohne Hirnverletzung. Naive Mäuse (im Alter von 2 Monaten) wurden keinem experimentellen Verfahren unterzogen.

Das Aβ1-6A2V(D) wurde Mäusen mit 3xTg-AD und 24 Monate alten WT-TBI durch wiederholte intranasale Verabreichung verabreicht, wie in [39] beschrieben. Kurz gesagt, die Mäuse wurden vor der Operation und der Behandlung zwei Wochen lang akklimatisiert. Aβ1-6A2V(D) wurde Mäusen mit 50 mg/kg Körpergewicht (KG) (ca. 5 µL/Nasenloch/Maus, 10 µL insgesamt/jede Behandlungssitzung/Maus) beginnend 10 Minuten nach der TBI und alle 48 Stunden verabreicht Bis zu 6 Tage nach der Verletzung mit einer 20-µL-Pipette und einer Gelladepipettenspitze. Bei jeder Behandlungssitzung wurden die Mäuse nach der ersten 5-µL-Verabreichung 30 Sekunden lang an Ort und Stelle gehalten und dann 30 Sekunden lang frei gelassen, um sich in einem Käfig zu bewegen, bevor die verbleibende Behandlung/das verbleibende Vehikel verabreicht wurde [39]. Das Gewicht wurde vor jeder intranasalen Verabreichung bestimmt. Die neurologischen Funktionen wurden in Längsrichtung überwacht und die Plasmaspiegel des Neurofilamentlichts (NfL) wurden bei der Tötung beurteilt, wie in den ergänzenden Informationen (Abschnitte „Verhaltenstest“ und „Plasmatisches Neurofilamentlicht“) beschrieben. Sieben Tage nach der Operation wurden die Mäuse getötet, das Gehirn entfernt und ipsilaterale kortikale Bereiche herauspräpariert, sofort auf Trockeneis eingefroren und bis zu ihrer Verwendung für biochemische und C. elegans-Studien bei –80 °C gelagert. 4 Stunden, 24 Stunden, 48 Stunden und 72 Stunden nach der Operation wurde eine Untergruppe von Mäusen (n = 3) getötet und ihre Gehirne entfernt, sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –80 °C gelagert, bis die Matrix- unterstützte Laser-Desorption/Ionisation (MALDI)-Bildgebungsanalyse. Bei der Auswertung der Ergebnisse waren die Prüfer hinsichtlich der Behandlungszuteilung blind.

Bristol N2-Nematoden wurden vom Caenorhabditis elegans Genetic Center (CGC, University of Minnesota, Minneapolis, MN, USA) erhalten und bei 20 °C auf festem Nematodenwachstumsmedium (NGM) vermehrt, das mit E. coli OP50 (CGC) als Nahrung besät war. Wir verwendeten die Bleichtechnik, um alterssynchronisierte Tiere vorzubereiten [40]. C. elegans im ersten Larvenstadium wurden dann auf frische NGM-Platten übertragen und bei 20 °C gezüchtet. Im L3-L4-Larvenstadium wurden Nematoden mit M9-Puffer gesammelt, zentrifugiert und zweimal mit 10 mM PBS (pH 7,4) gewaschen, um Bakterien zu eliminieren. Die Würmer wurden 2 Stunden lang bei Raumtemperatur unter orbitalem Schütteln in Abwesenheit von E. coli mit Gehirnhomogenaten von Non-tg- und P301L-Mäusen (30 µg Protein/100 Würmer/100 µL 10 mM PBS, pH 7,4) inkubiert Vorhandensein oder Fehlen von 50 µM Aβ1-6A2V(D), 50 µM TAT oder 0,1–200 µM Aβ1-6A2V-TAT(D). Kontrollwürmer wurden mit 10 mM PBS, pH 7,4 (Vehikel), 50 µM Aβ1-6A2V (D), 50 µM Aβ1-6A2V-TAT(D) oder 50 µM TAT (100 Würmer/100 µL) behandelt. Perikontusionale Gewebehomogenate von jungen WT-TBI-Mäusen 12 Monate nach der Verletzung oder altersentsprechenden Scheinmäusen wurden Würmern (30 µg Protein/100 Würmer/100 µL) in Abwesenheit oder Anwesenheit von 50 µM Aβ1-6A2V-TAT(D) verabreicht. . Perikontusionale Gewebehomogenate von 3xTg-AD-TBI-Mäusen sowie perikontusionales Gewebe von gealterten WT-TBI-Mäusen, die zuvor mit intranasal 50 mg/kg Körpergewicht Aβ1-6A2V(D) behandelt wurden oder nicht, und 7 Tage nach der Verletzung getötet (Zeitpunkt, zu dem beide 3xTg-AD und ältere TBI-Mäuse zeigten kognitive Beeinträchtigungen) wurden Würmern verabreicht (30 µg Protein/100 Würmer/100 µL 10 mM PBS, pH 7,4). Homogenate von naiven oder Scheinmäusen wurden Würmern als Kontrollen für 3xTg-AD- bzw. gealterte WT-TBI-Mäuse verabreicht ((30 µg Protein/100 Würmer/100 µL 10 mM PBS, pH 7,4). Als zusätzliche Negativkontrolle 10 mM Den Nematoden wurde PBS, pH 7,4 (100 Würmer/100 µL) verabreicht. Anschließend wurden die Würmer auf mit OP50 E. coli beimpfte NGM-Platten ausplattiert, bei 20 °C gezüchtet und jeden Tag auf neue mit E. coli beimpfte NGM-Platten übertragen Vermeiden Sie überlappende Generationen. Die Bewegungsaktivität von Nematoden wurde 7 Tage nach der Behandlung unter Blindbedingungen bewertet und als Körperbiegung pro Minute ausgedrückt [26].

C. elegans-Experimente wurden mit 100 Würmern pro Gruppe durchgeführt und basierend auf den auf http://www.wormbook.org beschriebenen Methoden mindestens dreimal wiederholt. Für C. elegans-Experimente war keine Randomisierung erforderlich. Für Wirksamkeitsstudien wurden die Mäuse mithilfe von Randomisierungslisten (www.randomizer.org) den verschiedenen Versuchsgruppen zugeordnet. Alle Bewertungen wurden blind für die Behandlungsgruppe und die Probenidentität durchgeführt. Die Daten wurden mit der Software GraphPad Prism 9.0 (CA, USA) anhand des Student-t-Tests, einer einfaktoriellen oder zweifaktoriellen ANOVA und des Post-hoc-Tests von Bonferroni oder Tukey analysiert. Die IC50-Werte wurden mit der gleichen Software ermittelt. Ein p-Wert < 0,05 wurde als signifikant angesehen. Die Daten wurden mittels Zwei-Wege-ANOVA für wiederholte Messungen im Falle von Längsschnittbewertungen (SNAP-Test) analysiert, gefolgt von einem Sidak-Post-hoc-Test.

Um das Multitarget-Potenzial des Aβ1-6A2V(D)-Peptids zu untersuchen, führten wir eine Reihe von Studien durch, die darauf abzielten, seine Fähigkeit, der Tau-Aggregation und -Toxizität entgegenzuwirken, zu bewerten. Wir verwendeten rekombinantes Tau, das in E. coli hergestellt wurde und keine posttranslationalen Modifikationen aufweist, die typischerweise in menschlichem Tau vorhanden sind. Die Kinetik der Tau-Aggregation wurde mithilfe des Thioflavin-T (ThT)-Fluoreszenztests und unter Verwendung von Heparin als Co-Aggregat überwacht [41, 42]. Zehn µM rekombinantes Tau in P301L-mutierter Form (Tau P301L) wurden bei 37 °C mit unterschiedlichen Tau-zu-Peptid-Molverhältnissen (1:4, 1:8 und 1:16) in Gegenwart von Heparin inkubiert. Das Peptid reduzierte die Aggregationsneigung von Tau P301L ab einem Molverhältnis von Tau: Aβ1-6A2V(D) von 1:8 deutlich, und bei einem Molverhältnis von 1:16 wurde eine nahezu vollständige Hemmung der Aggregation beobachtet, wie durch die ThT-Analyse bestimmt ( Abb. 1A). Das Molverhältnis von 1:8 Tau-zu-Peptid wurde dann als optimales Verhältnis für weitere Studien ausgewählt. Die ThT-Analyse zeigte, dass 16 µM Aβ1-6A2V(D) die Aggregationsneigung nicht nur von 2 µM Tau P301L, sondern auch von Tau-Wildtyp (WT) signifikant reduzierte (Abb. 1B, C). Um diese Ergebnisse zu bestätigen, wurden beide rekombinanten Tau-Isoformen vor (T0) und 24 Stunden (T24) nach der Inkubation mit dem Peptid unter den gleichen experimentellen Bedingungen wie oben beschrieben einer Rasterkraftmikroskopanalyse unterzogen (Abb. 1D, E). Diese Daten bestätigen, dass das Peptid die Tau-Aggregation hemmt, auch in seiner mutierten P301L-Form, die bekanntermaßen anfälliger für Fehlfaltungen ist.

A Die Aggregationsneigung von 10 µM P301L-Tau wurde durch einen fluorometrischen ThT-Assay in 10 mM Phosphatpuffer (PB), pH 7,4, bewertet, der ein Heparin (Tau/Heparin-Verhältnis von 4:1 (w/w)) und 5 mM Dithiothreitol enthielt ( DVB-T). Die ThT-Fluoreszenz wurde während der Inkubation bei 37 °C in Abwesenheit (Tau P301L) und Anwesenheit von Aβ1-6A2V(D) bei einem Tau-zu-Peptid-Molverhältnis von 1:8 oder 1:16 gemessen. Jeder Wert stellt den Mittelwert ± SE aus drei verschiedenen Experimenten (N = 3) dar und wird in willkürlichen Einheiten (au) ausgedrückt. Die Aggregationsneigung von 2 µM (B) Tau P301L und (C) Tau WT wurde durch ThT-Assay durch Messung der Fluoreszenzintensität während der Inkubation bei 37 °C in Gegenwart von entweder 16 µM Aβ1-6A2V(D) oder dem gleichen Volumen bewertet von PB, pH 7,4 (Fahrzeug). Jeder Wert stellt den Mittelwert ± SE aus 3 verschiedenen Experimenten (N = 4) dar und wird in willkürlichen Einheiten (au) ausgedrückt. D, E Repräsentative Rasterkraftmikroskopbilder wurden an Tau-Proben unmittelbar vor Beginn der Inkubation (T0) und 24 Stunden später (T24) der Inkubation mit dem Peptid unter den gleichen experimentellen Bedingungen wie in B und C erhalten. Bilder wurden beim Klopfen erhalten Modus und werden als Amplitudendaten angezeigt. Maßstabsbalken = 1 µm, Farbskala: 0–150 mV.

Um die Fähigkeit des Peptids zu untersuchen, der Tau-Toxizität in vivo entgegenzuwirken, nutzten wir C. elegans als Biosensor, der in der Lage ist, die toxischen Formen von Tau spezifisch zu erkennen. Gehirnhomogenate von P301L-transgenen Mäusen wurden als Quelle für fehlgefaltetes toxisches Tau verwendet [26] und Würmern allein oder in Gegenwart einer steigenden Konzentration von Aβ1-6A2V(D) oder Aβ1-6A2V-TAT(D) verabreicht. Dieses letztere Peptid wurde verwendet, da wir zuvor gezeigt hatten, dass Aβ1-6A2V(D) nur in Gegenwart der TAT-Sequenz die Membran des Wurms passieren kann, was seine Schutzwirkung gegen Aβ-Toxizität ermöglicht [18]. Wie in Abb. 2A–C gezeigt, schützte Aβ1-6A2V-TAT(D), aber nicht Aβ1-6A2V(D), Würmer vor der Toxizität, die durch P301L-Gehirnhomogenate verursacht wird. Der Effekt war dosisabhängig, mit einem IC50-Wert von 25,60 µM. Peptide allein verursachten in einer Konzentration von 50 µM keine toxischen Wirkungen bei C. elegans (Abb. 2C). Wir haben auch die Fähigkeit von Aβ1-6A2V-TAT(D) getestet, der Toxizität einer abnormalen Form von Tau entgegenzuwirken, die 12 Monate nach TBI in WT-Mäusen erzeugt wurde. Wie zuvor gezeigt, verursachten Gehirnhomogenate von WT-TBI-Mäusen im Gegensatz zu denen von Scheinmäusen eine toxische Wirkung bei C. elegans, die durch 50 µM Aβ1-6A2V-TAT(D) vollständig rückgängig gemacht wurde (Abb. 2D).

A Gehirne von P301L-Mäusen wurden in 10 mM PBS, pH 7,4, homogenisiert und Würmern allein oder in Gegenwart von Aβ1-6A2V-TAT(D) verabreicht. B-Würmern wurde Gehirnhomogenat (30 µg Protein/100 Würmer/100 µL) in Abwesenheit oder Anwesenheit von Aβ1-6A2V-TAT(D) (0–200 µM) verabreicht. Kontrollwürmer wurden mit 10 mM PBS, pH 7,4 (100 Würmer/100 µL) behandelt (gepunktete Linie). Die Bewegungsaktivität der Nematoden wurde 7 Tage nach der Behandlung bewertet. Die Daten sind der Mittelwert ± SEM von drei unabhängigen Experimenten (N = 30). C Gehirnhomogenate von nicht-transgenen (Non-tg) und P301L-Mäusen wurden Würmern verabreicht (30 µg Protein/100 Würmer/100 µL). Hirnhomogenat aus P301L wurde auch in Gegenwart von 50 µM Aβ1-6A2V(D), 50 µM Aβ1-6A2V-TAT(D) oder 50 µM TAT-Peptid allein verabreicht. Kontrollwürmer wurden mit 10 mM PBS, pH 7,4 (Vehikel), 50 µM Aβ1-6A2V (D), 50 µM Aβ1-6A2V-TAT(D) oder 50 µM TAT allein (100 Würmer/100 µL) behandelt. Die Bewegungsaktivität der Nematoden wurde 7 Tage nach der Behandlung bewertet. °°°°p < 0,0001 und ****p < 0,0001 vs. Vehikel, einfaktorielle ANOVA und Bonferronis Post-hoc-Test. Interaktion P301L/ Aβ1-6A2V-TAT(D) = 0,001, Zwei-Wege-ANOVA und Bonferroni-Post-hoc-Test. D Perikontusionales Gewebe von WT-Sham- und TBI-Mäusen 12 Monate nach der Verletzung (TBI) wurde in 10 mM PBS, pH 7,4, homogenisiert und Würmern (30 µg Protein/100 Würmer/100 µL) in Abwesenheit oder Anwesenheit von 50 µM verabreicht Aβ1-6A2V-TAT(D). Kontrollwürmer wurden mit 10 mM PBS, pH 7,4 (100 Würmer/100 µL) (Vehikel) behandelt. Die Bewegungsaktivität der Nematoden wurde 7 Tage nach der Behandlung bewertet. Die Daten sind der Mittelwert ± SEM von drei unabhängigen Experimenten (N = 30). ****p < 0,0001 vs. Fahrzeug-Aβ1-6A2V-TAT(D), §§§§p < 0,0001 vs. Schein-Aβ1-6A2V-TAT(D), °p < 0,05, einfaktorielle ANOVA und Bonferronis Beitrag Hoc-Test. Interaktion TBI/Aβ1-6A2V-TAT(D) = 0,05, Zwei-Wege-ANOVA und Bonferroni-Post-hoc-Test. E–G-Lysate wurden aus den Gehirnhomogenaten von P301L-Mäusen hergestellt. E, F P301L-Gehirnlysat (30 µg Protein/100 µL) wurde 2 Stunden lang bei 25 °C mit 50 µM Aβ1-6A2V-TAT(D) (P301L + Aβ1-6A2V-TAT(D)) oder 10 mM PBS inkubiert , pH 7,4 (P301L). E Repräsentatives Western-Blot, das das Gesamtniveau an Tau und die Tau-Quantifizierung zeigt, ausgedrückt als mittleres Volumen der DAKO-Bande-Immunreaktivität/Actin-Bande. Die Daten sind Mittelwerte ± SD (N = 3). *p < 0,05, Student-T-Test. F Repräsentatives Western-Blot, das den Detergenzienunlöslichkeitstest von löslichen (S) und unlöslichen (I) Fraktionen zeigt, die mit Anti-Tau-DAKO-Antikörpern oder Anti-Aktin-Antikörpern untersucht wurden. G Wirkung von Aβ1-6A2V-TAT(D) auf die Proteolyse. P301L-Gehirnhomogenate (30 µg Protein/100 µL) wurden 30 Minuten lang bei 37 °C mit 50 µM Aβ1-6A2V-TAT(D) oder dem äquivalenten Volumen von 10 mM PBS, pH 7,4, in Gegenwart oder Abwesenheit von 2,5 inkubiert µg/ml Proteinase K (PK). Anschließend wurde die Reaktion gestoppt und die Proben mittels Western Blot analysiert. Repräsentatives Western-Blot, das die Proteolyse von Tau zeigt, das mit Anti-Tau-DAKO-Antikörpern oder Anti-Actin-Antikörpern untersucht wurde.

Anschließend wurden biochemische Analysen durchgeführt, um die Mechanismen aufzuklären, die dieser Schutzwirkung zugrunde liegen. Die Inkubation des P301L-Gehirnhomogenats mit Aβ1-6A2V-TAT(D) oder Aβ1-6A2V(D), jedoch nicht mit TAT allein, reduzierte den Tau-Proteinspiegel signifikant (Abb. 2E und ergänzende Abb. 1), ohne den Anteil von zu beeinflussen unlösliches Tau (Abb. 2F und ergänzende Abb. 2). Bemerkenswerterweise erhöhte das Peptid die Anfälligkeit von Tau für den Abbau durch Proteasen, und dies zeigte sich besonders deutlich in Gegenwart von Proteinase K (Abb. 2G und ergänzende Abb. 3).

TBI beschleunigt die Tau-Ablagerung bei AD-anfälligen Mäusen, insbesondere bei 3xTg-AD-Mäusen. Daher entschieden wir uns, die Schutzwirkung von Aβ1-6A2V(D) bei diesem Stamm anhand junger TBI-Mäuse zu bewerten und einen Behandlungsplan anzuwenden, der sich bereits in einem Mausmodell für AD als wirksam erwiesen hatte [16]. Wir führten eine MALDI-TOF-Bildgebungsstudie durch, um zu beurteilen, ob das Peptid, wie bei APPSwe/PS1dE9-Mäusen beobachtet [16], nach intranasaler Verabreichung effizient im Gehirn von TBI-Mäusen verteilt wurde. Als Kontrollen dienten Tiere, die Vehikel erhielten (4 Stunden nach TBI). Wie in Abb. 3 gezeigt, war das Peptid 4 Stunden und 24 Stunden nach der Verletzung in der Großhirnrinde, im Hippocampus, im Caudat-Putamen und im Kleinhirn vorhanden. Bemerkenswerterweise wurden hohe Aβ1-6A2V(D)-Spiegel in der ipsi- und kontralateralen Hemisphäre festgestellt, die, wenn auch in geringen Mengen, bis zu 48 Stunden anhielten und 72 Stunden nach der Verabreichung nicht mehr nachweisbar waren (Abb. 3 und ergänzende Abb. 4-5). Basierend auf diesen Beobachtungen und den bereits veröffentlichten Daten [16] haben wir einen Behandlungsplan ausgewählt, der aus der intranasalen Verabreichung von Aβ1-6A2V(D) an Mäuse alle 48 Stunden besteht. Daher wurden 3xTg-AD-Mäuse TBI ausgesetzt und beginnend 10 Minuten nach der Verletzung und dann alle 48 Stunden bis zu 7 Tage nach TBI mit 50 mg/kg Körpergewicht Aβ1-6A2V(D) oder Kochsalzlösung behandelt (Abb. 4A). TBI verursachte 7 Tage nach der Verletzung ein deutliches räumliches Gedächtnisdefizit im Y-Labyrinth, und die Verabreichung von Aβ1-6A2V(D) schwächte die Gedächtnisbeeinträchtigung deutlich ab, wie die Zunahme der im neuen Arm des Labyrinths verbrachten Zeit zeigte (Abb. 4B).

A Mäuse wurden einem TBI ausgesetzt, zufällig in zwei Gruppen aufgeteilt und 10 Minuten nach der Verletzung intranasal entweder mit einer Einzeldosis Aβ1-6A2V(D) (50 mg/kg Körpergewicht) oder Kochsalzlösung (Vehikel) behandelt. MALDI-Bildgebungsanalysen wurden 4 Stunden, 24 Stunden, 48 Stunden und 72 Stunden nach der Verabreichung durchgeführt. B Repräsentative Bilder der Bioverteilung von Aβ1-6A2V(D), bewertet durch MALDI-TOF und abgebildet als Heatmap (rot > Aβ1-6A2V(D)-Konzentration > tiefviolett).

Eine schematische Darstellung des experimentellen Designs, des Aβ1-6A2V(D)-Behandlungsparadigmas und der kognitiven Tests. 3xTg-AD TBI-Mäusen wurde 10 Minuten nach der Verletzung und danach alle 48 Stunden entweder Aβ1-6A2V(D) (50 mg/kg Körpergewicht) oder Kochsalzlösung (Vehikel) intranasal verabreicht. (B) Die kognitive Funktion von TBI-Mäusen, die mit Aβ1-6A2V(D) oder Vehikel behandelt wurden, wurde nach 7 Tagen durch den Y-Labyrinth-Test mit zwei Versuchen beurteilt. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM *p < 0,5 (n = 7), gepaarter Student-T-Test. C-Würmern wurde Gehirnhomogenat von naiven oder 3xTg-AD-TBI-Mäusen verabreicht, die mit Aβ1-6A2V(D) (TBI Aβ1-6A2V(D)) oder Vehikel (TBI-Vehikel) (30 µg Protein/100 Würmer/100 µL) behandelt wurden. D Die Bewegungsaktivität der Nematoden wurde 7 Tage nach der Behandlung bewertet. Die Daten sind der Mittelwert ± SEM von drei unabhängigen Experimenten (n = 20). ****p < 0,0001, einfache ANOVA und Bonferronis Post-Hoc-Test. E Repräsentative Western-Blots von Aβ in Gehirnlysaten von 3xTg-AD-TBI-Mäusen, die mit Vehikel (TBI-Vehikel) oder Aβ1-6A2V(D) (TBI Aβ1-6A2V(D)) behandelt wurden. Gleiche Mengen an Proteinen wurden in jede Gelspur geladen und mit Anti-Aβ- (6E10) oder Anti-Aktin-Antikörpern immungeblottet. Die F Aβ-Quantifizierung wurde als mittleres Volumen der 6E10-Bande-Immunreaktivität/Actin-Bande ausgedrückt. Die Daten sind Mittelwerte ± SD (n = 3). **p < 0,01, einfaktorielle ANOVA und Bonferronis Post-Hoc-Test.

Wir haben zuvor herausgefunden, dass abnormales Tau, das sich bei TBI-Mäusen ansammelt, für die Beeinträchtigung der Bewegungsfunktion bei C. elegans verantwortlich ist [26]. Wir fragten nun, ob die Behandlung mit Aβ1-6A2V(D) bei 3xTg-AD-TBI-Mäusen in der Lage war, die Tau- und Aβ-Belastung zu reduzieren und so die Toxizität des Homogenats zu mildern. Die Würmer wurden mit Gehirnhomogenaten von naiven Mäusen und mit TBI-Vehikel oder Aβ1-6A2V(D) behandelten Mäusen inkubiert. Die Häufigkeit der Körperbeugungen wurde nach 7 Tagen bewertet. Im Vergleich zu naiven Homogenaten war das TBI-Vehikel toxisch für C. elegans (p < 0,001, Abb. 4D) und die Behandlung mit Aβ1-6A2V(D) beseitigte diese Toxizität vollständig (p < 0,001 im Vergleich zum TBI-Vehikel). Diese Schutzwirkung war nicht mit Veränderungen des menschlichen Tau-, P-Tau-Spiegels sowie des P-Tau/Tau-Verhältnisses in Gehirnhomogenaten verbunden, was möglicherweise durch die intrinsisch hohen Werte der Tau-P301L-Expression in diesem transgenen Stamm erklärt wird (ergänzende Abbildung 6). . Bemerkenswerterweise waren die Aβ-Spiegel in den Gehirnen der 3xTg-AD-TBI-Mäuse, die Aβ1-6A2V(D) erhielten, signifikant reduziert (Abb. 4E, F), was die Verringerung der Amyloidbelastung in dieser Versuchsgruppe bestätigt. Dieses Ergebnis kann teilweise durch die Fähigkeit des Peptids erklärt werden, die Aktivität von BACE in vitro mit einem IC50-Wert von 126 nM dosisabhängig zu hemmen (ergänzende Abbildung 7A). Das Fehlen von Unterschieden in der BACE-Aktivität zwischen den Gehirnhomogenaten von 3xTg-AD-TBI-Mäusen, die mit dem Peptid behandelt oder nicht behandelt wurden (ergänzende Abbildung 7B), lässt jedoch darauf schließen, dass der angewendete Behandlungsplan in vivo kurzfristige Veränderungen hervorrufen kann, die nicht mehr der Fall waren 24 Stunden nach der Verabreichung beobachtbar. Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass andere Mechanismen, die zur Verringerung der Aβ-Menge führen, wie beispielsweise eine Wirkung des Peptids auf seine Clearance, zur Verringerung der Amyloidbelastung beitragen können.

Ähnlich wie beim Menschen zeigen normal alternde WT-Mäuse eine Zunahme der Tau-Ablagerung im Gehirn [43,44,45]. Darüber hinaus weisen weibliche Nagetiere im Vergleich zu männlichen Nagetieren eine erhöhte Tau-Pathologie im gesamten Parietal-Hippocampus-Netzwerk auf, was positiv mit neurologischen Dysfunktionen korreliert [43, 44]. Da Frauen bei älteren Menschen im Vergleich zu Männern eine höhere Inzidenz von Schädel-Hirn-Trauma aufgrund von Stürzen aufweisen [46], könnte die Untersuchung der Auswirkungen von Aβ1-6A2V(D) bei WT-Mäusen im weiblichen Alter von hoher klinischer Relevanz sein. Darüber hinaus entwickeln normal alternde WT-Mäuse im Gegensatz zum Menschen keine Aβ-Plaques, was wahrscheinlich auf Unterschiede in der Aβ-Sequenz zwischen Nagetieren und Menschen zurückzuführen ist (47, 48). Experimente an älteren weiblichen WT-TBI-Mäusen ermöglichen es uns daher zu testen, ob der Aβ1-6A2V(D)-Schutz auch in Abwesenheit einer Aβ-Pathologie erhalten bleibt (Abb. 5A). Mit TBI Aβ1-6A2V(D) behandelte Mäuse zeigten bis zu 7 Tage nach der Verletzung eine signifikante Verbesserung der sensomotorischen Beeinträchtigungen im Vergleich zum TBI-Vehikel (p < 0,05, Abb. 5B). Bis zum 7. Tag war das Körpergewicht bei mit TBI-Vehikel behandelten Mäusen verringert, nicht jedoch bei mit TBI Aβ1-6A2V(D) behandelten Mäusen im Vergleich zu Scheinmäusen (Abb. 5C). In ähnlicher Weise war auch die Bewegungsaktivität bei TBI-Vehikelmäusen verringert (p <0, 05 gegenüber Schein), während bei mit TBI Aβ1-6A2V (D) behandelten Mäusen kein Unterschied zum Schein festgestellt wurde (ergänzende Abbildung 8). TBI-Mäuse zeigten 7 Tage nach der Verletzung im Y-Labyrinth ein deutliches Gedächtnisdefizit. Die Behandlung mit Aβ1-6A2V(D) verbesserte die Gedächtnisfunktion auf ein mit Scheinmäusen vergleichbares Niveau (TBI Aβ1-6A2V(D): p < 0,05, Schein: p < 0,05 neuer Arm vs. vertraut, Abb. 5D). Darüber hinaus reduzierte die Behandlung mit Aβ1-6A2V(D) die plasmatischen NfL-Spiegel signifikant (p < 0,01 vs. TBI), was auf die Fähigkeit des Peptids hinweist, vor der durch TBI verursachten axonalen Schädigung zu schützen [49]. Das Radardiagramm in Abb. 5F zeigt die globale Wirkung von Aβ1-6A2V(D) auf die Ergebnisparameter, ausgedrückt als Z-Scores. Eine an den Gehirnhomogenaten dieser Mäuse durchgeführte biochemische Analyse ergab, dass die Aβ1-6A2V(D)-Behandlung die P-Tau-Spiegel und das P-Tau/Tau-Verhältnis (Abb. 6A, C, D) signifikant reduzierte, nicht jedoch die Spiegel des gesamten Tau (Abb. 6B). Die Verabreichung von Gehirnhomogenaten aus dem TBI-Vehikel an C. elegans reduzierte die Bewegungsaktivität der Würmer nach 7 Tagen deutlich. Diese toxische Wirkung wurde bei Würmern, denen Homogenate von mit Aβ1-6A2V(D) behandelten Mäusen verabreicht wurden, nicht beobachtet (p < 0,001, Abb. 6E, F).

Ein Schema des experimentellen Designs, des Aβ1-6A2V(D)-Behandlungsparadigmas und der kognitiven Tests. Älteren (24 Monate alten) TBI-WT-Mäusen wurde 10 Minuten nach der Verletzung und dann alle 48 Stunden intranasal 50 mg/kg Körpergewicht Aβ1-6A2V(D) (TBI Aβ1-6A2V(D)) oder Kochsalzlösung (TBI-Vehikel) verabreicht danach. B Die sensomotorische Funktion wurde bei mit TBI-Vehikel und TBI Aβ1-6A2V(D) behandelten Mäusen (n = 8–10) durch SNAP-Tests 2 und 7 Tage nach der Verletzung beurteilt. Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± SEM und zweifaktorielle RM-ANOVA. Signifikante Gruppeneffekte von Zeit, Behandlung und Interaktion sind im Kasten dargestellt. C Das Körpergewicht wurde 7 Tage nach der Verletzung bestimmt und als Prozentsatz gegenüber dem Wert vor der Operation ausgedrückt. Bei den Daten handelt es sich um Mittelwerte ± SEM (n = 8–10), **p < 0,01, einfaktorielle ANOVA und Tukeys Post-hoc-Test. D Die kognitive Funktion wurde sieben Tage nach der Schädel-Hirn-Trauma mit dem Y-Labyrinth-Test mit zwei Versuchen beurteilt. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM, *p ≤ 0,5, ***p < 0,01, gepaarter Student-t-Test. E Plasma-NFL-Spiegel wurden 7 Tage nach der Schädel-Hirn-Trauma quantifiziert. Die gestrichelten Linien stellen den Mittelwert ± SEM des Scheins dar. Die Daten sind Mittelwerte ± SEM (N = 8–10), *p < 0,5, ungepaarter Student-t-Test. F-Radardiagramm, das die Auswirkungen der TBI- und Aβ1-6A2V(D)-Behandlung auf mehrere Parameter zusammenfasst, einschließlich sensomotorischer und kognitiver Funktionen, Gewicht und NfL-Werte als Ersatzmarker für axonale Verletzungen, ausgedrückt als Z-Score. Die Ergebnisse werden als Mittelwert dargestellt.

Ein repräsentativer Western-Blot von gesamtem und phosphoryliertem (P) Tau und dem P-Tau/Tau-Verhältnis in Lysaten aus dem ipsilateralen Kortex von gealterten WT-Schein- und TBI-Mäusen, die entweder mit Kochsalzlösung (TBI-Vehikel) oder 50 mg/kg Körpergewicht Aβ1-6A2V behandelt wurden (D) (TBI Aβ1-6A2V(D)). Gleiche Mengen an Proteinen wurden in jede Gelspur geladen und mit Anti-Gesamt-Tau-Antikörpern (DAKO), Anti-P-Tau-Antikörpern (198-199-202-205) oder Anti-Actin-Antikörpern immungeblottet. B, C Quantifizierung des gesamten Tau- und P-Tau-Gehalts in Gehirnlysaten. Die Daten sind auf Aktinspiegel normalisiert und stellen den Mittelwert ± SD dar (N = 6 für Tau und N = 10 für P.tau). **p < 0,01, einfaktorielle ANOVA und Bonferronis Post-Hoc-Test. D P-Tau/Tau wurde als Verhältnis des Immunreaktivitätssignals von P-Tau/Aktin zum Gesamt-Tau/Aktin berechnet. Die Daten sind Mittelwert ± SD (N = 7) *p < 0,5, einfache ANOVA und Bonferroni-Post-hoc-Test. Den E-Würmern wurde Schein-Homogenat, TBI-Vehikel oder TBI Aβ1-6A2V(D) (30 µg Protein/100 Würmer/100 µL) verabreicht. F Die Bewegungsaktivität der Nematoden wurde 7 Tage nach der Behandlung bewertet. Die Daten sind der Mittelwert ± SEM von drei unabhängigen Experimenten (N = 80). ****p < 0,0001, einfache ANOVA und Bonferronis Post-Hoc-Test.

Diese Studie ergibt sich aus der Notwendigkeit, den schützenden Wirkungsmechanismus von Aβ1-6A2V(D) gegen AD-Pathologie, der zuvor in vitro- und in vivo-Modellen nachgewiesen wurde, besser zu verstehen [16, 22]. Mit der Idee, dass Tau, das neben Aβ den anderen wichtigen Schlüsselakteur beim Ausbruch und Fortschreiten der Alzheimer-Krankheit darstellt, ein medikamentöses Ziel der Peptidaktivität sein könnte, haben wir die potenziellen Schutzwirkungen von Aβ1-6A2V(D) gegen die Toxizität von untersucht Tau-Protein.

TBI ist ein wichtiger umweltbedingter Risikofaktor für neurodegenerative Erkrankungen wie AD [50,51,52,53,54]. Postmortales Hirngewebe von Patienten mit traumatischer Hirntumoranamnese weist mehrere Proteinopathien auf und kommt häufig bei altersbedingten neurodegenerativen Erkrankungen vor [55]. Ob eine Beeinträchtigung der Proteine, die sich nach einer Schädel-Hirn-Trauma ansammeln, einschließlich Tau und Aβ, Schutz vor der Entwicklung einer Demenz im späteren Leben bieten und kognitive Dysfunktionen abschwächen kann, muss noch vollständig untersucht werden.

In dieser Studie zeigten wir zunächst das Multitarget-Potenzial von Aβ1-6A2V(D), indem wir bestätigten, dass das Peptid die In-vitro-Aggregation von Tau sogar in seiner mutierten P301L-Form hemmte, die bekanntermaßen anfälliger für Fehlfaltungen ist. Als nächstes untersuchten wir mit C. elegans als Biosensor die Wirkung von Aβ1-6A2V(D) auf die Proteotoxizität von Tau-Isoformen [26, 27]. Dieser Ansatz führte zu bemerkenswerten Synergien und ermöglichte uns einen tieferen Einblick in die Aktivität von Aβ1-6A2V(D). Insbesondere das C. elegans-Modell lieferte detaillierte Informationen auf biochemischer Ebene, was bei Wirbeltieren insbesondere in kurzer Zeit schwer zu erreichen ist.

Die relevanteste Beobachtung unserer biochemischen Studien war, dass die Schutzwirkung von Aβ1-6A2V(D) auf seine Fähigkeit zurückzuführen ist, nicht nur die Tau-Aggregation zu behindern, sondern auch seinen Abbau durch Gewebeproteasen zu begünstigen. Diese letztgenannte unerwartete Beobachtung enthüllt einen neuen intrinsischen Mechanismus, der vom Peptid genutzt wird und der noch geklärt werden muss.

Schließlich haben wir im TBI-Modell die Relevanz der Aβ1-6A2V(D)-Akutbehandlung zur Verbesserung der neurologischen Ergebnisse im Zusammenhang mit genetischer oder altersbedingter Prädisposition für AD getestet. TBI führt durch kontrollierte kortikale Wirkung innerhalb von 24 Stunden nach der Verletzung zur Akkumulation von hyperphosphoryliertem Tau bei dreifach transgenen Mäusen, die menschliches Tau-Protein und menschliches Aβ-Peptid exprimieren [34, 56, 57]. Daher wählten wir zunächst 3xTg-AD-Mäuse aus, um die schützende Wirkung von Aβ1-6A2V(D) auf TBI zu untersuchen. Kürzlich wurde gezeigt, dass eine einmalige intranasale Verabreichung des Peptids im Gehirn von AD-Mäusen verteilt wird [16]. Unsere Ergebnisse bestätigen und erweitern diese Ergebnisse, indem sie zeigen, dass Aβ1-6A2V(D) nach TBI effizient Gehirnbereiche in der Nähe der Kontusionsstelle erreichen kann, wobei 24 Stunden nach der Verabreichung noch hohe Peptidkonzentrationen nachweisbar sind.

Wir fanden heraus, dass die Verabreichung von Aβ1-6A2V(D) 10 Minuten nach der Verletzung und dreimal alle 48 Stunden wiederholt das Auftreten eines Gedächtnisdefizits verhinderte, ein bekanntes pathologisches Merkmal sowohl von 3xTg-AD [58, 59] als auch von TBI [60]. Mäuse. Die biochemische Analyse der Gehirnhomogenate zeigte eine deutliche Reduzierung von Aβ bei Mäusen, die mit dem Peptid behandelt wurden, was auf seine vielfältigen Mechanismen, einschließlich der hemmenden Wirkung von BACE, zurückzuführen ist. Ein ähnlicher Effekt auf die Verarbeitung des Amyloid-Vorläuferproteins (APP) wurde bei Probanden behauptet, die die schützende A673T-Substitution im APP-Gen trugen [61]. Diese Ergebnisse legen nahe, dass A2X-Substitutionen in der Aβ-Sequenz zu vorteilhaften Multitarget-Effekten führen können.

Obwohl die Behandlung von TBI 3xTg-AD-Mäusen mit dem Peptid keinen signifikanten Effekt auf die Gesamt-Tau- oder P-Tau-Spiegel hatte, konnte es die Toxizität der Gehirnhomogenate nach der Verabreichung an die Würmer reduzieren und bewies damit seine Fähigkeit, die proteotoxische Wirkung zu reduzieren Tau-Formen. Dies kann von verschiedenen Faktoren abhängen, beispielsweise von der Tatsache, dass trotz der Überexpression vergleichbarer Mengen an APP- und Tau-Transgenen bei diesen Mäusen zuerst eine Aβ-Pathologie auftritt und sich dann auf die Entwicklung einer Tau-Neuropathologie auswirkt [34].

Als nächstes testeten wir, ob bei älteren WT-Mäusen, die eine erhöhte Tau-Ablagerung im Gehirn zeigten [62] und als zweiter neurodegenerativer Treffer TBI ausgesetzt waren [28], die Behandlung mit Aβ1-6A2V(D) auch bei der Abschwächung kognitiver Beeinträchtigungen wirksam war. Wir beobachteten, dass das Hexapeptid TBI-induzierte sensomotorische Defizite abschwächte. Dieses Ergebnis steht im Einklang mit den Erkenntnissen, dass mit Vehikel behandelte, aber nicht mit Aβ1-6A2V(D) behandelte Mäuse eine Verringerung des Körpergewichts und der Bewegungsaktivität zeigten, was auf einen insgesamt gesünderen Zustand älterer TBI-Mäuse schließen lässt, die mit Aβ1-6A2V(D) behandelt wurden( D). Ähnlich wie bei den 3xTg-AD-TBI-Mäusen wurde eine akute Beeinträchtigung des räumlichen Gedächtnisses durch die Verabreichung von Aβ1-6A2V(D) verhindert. Im Einklang mit den positiven Auswirkungen des Peptids auf funktionelle Ergebnisse wurden die Plasmaspiegel von NfL, einem validierten Marker für axonale Verletzungen, der bekanntermaßen mit den Langzeitergebnissen nach TBI korreliert [49], durch die Behandlung reduziert. Die Wirkung von Aβ1-6A2V(D) auf das funktionelle Ergebnis war mäßig, zeigte sich jedoch bei mehreren Ergebnisparametern, einschließlich kognitivem Ergebnis, Gewichtsverlust und axonaler Schädigung, was seinen translatorischen Wert hervorhebt. Darüber hinaus zeigte die biochemische Analyse der Gehirnhomogenate eine Verringerung der P-Tau-Spiegel und des P-Tau/Tau-Verhältnisses [43, 44, 62].

Bemerkenswerterweise war es bei alten WT-Mäusen nicht möglich, die Aβ-Spiegel zu bestimmen, da sich das menschliche und das murine APP an drei Aminosäureresten innerhalb der Aβ-Peptidsequenz unterscheiden [63]. Diese Unterschiede sowie die unterschiedlichen Spaltstellen von APP durch Maus-BACE1 [63] verringern die Neigung älterer Mäuse, spontan Aβ-Plaques zu entwickeln.

Wir haben zuvor herausgefunden, dass die Tau-Pathologie für C. elegans toxisch ist und einen selektiven Defekt in der Bewegungsaktivität aufweist, der durch die Exposition gegenüber chronischem, aber nicht akutem TBI-Gewebe junger WT-Mäuse hervorgerufen wird [26]. Hier haben wir gezeigt, dass im Falle einer genetisch bedingten oder altersbedingten P-Tau-Pathologie sogar akutes TBI-Gehirngewebe für C. elegans toxisch ist. Bei 3xTg-AD-Mäusen könnte auch eine Fehlfaltung von Aβ neben P-Tau an der beobachteten Toxizität beteiligt sein. Die Verabreichung von Aβ an C. elegans führte nur zu einer Beeinträchtigung des Rachenraums, ohne die Motilität der Würmer zu beeinträchtigen [18, 20]. In mit Nematoden gefütterten TBI-Geweben von 3xTg-AD-Mäusen wurde keine pharyngeale Dysfunktion festgestellt (Daten nicht gezeigt), was auf die primäre Rolle von Tau bei der TBI-bedingten Toxizität hinweist. Wichtig ist, dass unser Biosensor-Ansatz zeigte, dass die Behandlung mit Aβ1-6A2V(D) sowohl bei TBI-Mäusen im 3xTg-AD- als auch im WT-Alter die TBI-induzierte Toxizität bei C. elegans vollständig beseitigte. Somit verdeutlichen die Daten eine Multizielwirkung der Aβ1-6A2V(D)-Behandlung, die möglicherweise sowohl die Aβ- als auch die Tau-induzierte Toxizität nach TBI mildert.

Auch wenn die unterstützende Behandlung des Schädel-Hirn-Trauma in den letzten 20 Jahren Fortschritte gemacht hat, fehlen spezifische neuroprotektive Strategien und es besteht ein dringender Bedarf an neuen therapeutischen Interventionen. Insgesamt zeigen unsere Daten, dass Aβ1-6A2V(D) die funktionellen Ergebnisse nach TBI verbesserte und die Toxizität von durch TBI ausgelösten Proteinopathien verringerte. Wichtig ist, dass seine Wirksamkeit bei älteren TBI-Mäusen seine potenzielle Anwendung in der älteren Bevölkerung verdeutlichen könnte. Dies könnte eine wichtige Erkenntnis sein, da die Zahl älterer SHT-Patienten zunimmt und das Alter ein starker Prädiktor für Mortalität und ungünstige Ergebnisse nach TBI ist [64]. Weitere Studien sind erforderlich, um die Wirksamkeit von Aβ1-6A2V(D) in Abhängigkeit vom Alter zu untersuchen.

Unsere Aufgabe kann nicht als abgeschlossen betrachtet werden, da Aβ1-6A2V(D) möglicherweise noch andere Ziele hat, die seine Schutzaktivität steuern. Weitere Studien sind im Gange, um die mögliche Beteiligung anderer Mechanismen aufzudecken, die der schützenden Wirkung von Aβ1-6A2V(D) auf den Beginn und das Fortschreiten von AD sowie anderen Tauopathien zugrunde liegen.

Abschließend können wir sagen, dass Aβ1-6A2V(D) ein Multi-Target-Peptid ist, das nicht nur gegen den toxischen Aβ-Weg, sondern auch gegen die Tau-Kaskade kämpft, wie in der ergänzenden Abbildung 9 dargestellt. Diese bahnbrechende Beobachtung eröffnet eine Welt voller Möglichkeiten, eine Chance, das aktuelle pharmakologische Arsenal zu verbessern, das nur spezifische Ziele der AD-Pathologie anspricht.

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Diese Studie wurde durch das aktuelle Forschungsprogramm des italienischen Gesundheitsministeriums (RC) an GDF und MC, Gesundheitsministerium – 5×1000/2017 an GDF, Fondazione Sacchetti 2022-2023 an MS und LD, FONDAZIONE REGIONALE PER LA RICERCA unterstützt BIOMEDICA (Care4NeuroRare CP_20/2018) bis LD. C. elegans und OP50 E. coli wurden vom GCG bereitgestellt, das durch die NIH Office Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) finanziert wird.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Luisa Diomede, Elisa R. Zanier.

Abteilung für Molekulare Biochemie und Pharmakologie, Mario Negri Pharmacological Research Institute IRCCS, Via Mario Negri 2, Mailand, Italien

Luisa Diomede, Laura Colombo, Luca Russo, Alfredo Cagnotto, Carmina Natale, Federica Marta Xodo, Ada De Luigi, Michele Mosconi, Marten Beeg und Mario Salmona

Abteilung für Neurowissenschaften, Mario Negri Institute for Pharmacological Research IRCCS, Via Mario Negri 2, Mailand, Italien

Elisa R. Zanier, Federico Moro und Gloria Vegliante

Neurologie V – Abteilung für Neuropathologie, IRCCS-Stiftung Carlo Besta Neurological Institute, Via Celoria 11, Mailand, Italien

Marcella Catania, Giacomina Rossi, Fabrizio Tagliavini und Giuseppe Di Fede

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MS, LD und ERZ haben die vorgestellte Idee konzipiert. FM, GV, LC, LR, AC, CN, FMX, ADL, MM, MB, MC und GR führten die Experimente durch. MS, LD und ERZ betreuten das Projekt. FT und GDF halfen bei der Überwachung des Projekts. MS, LD und ERZ haben das Manuskript mit Unterstützung von FM und CN verfasst. Alle Autoren diskutierten die Ergebnisse und trugen zum endgültigen Manuskript bei.

Korrespondenz mit Luisa Diomede oder Mario Salmona.

GDF und FT haben zwei Patente (EP2220251A2 und WO2021001405) im Zusammenhang mit dieser Arbeit. MS verfügt über ein Patent (WO2021/001405) im Zusammenhang mit dieser Arbeit.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Diomede, L., Zanier, ER, Moro, F. et al. Das Aβ1-6A2V(D)-Peptid wirkt auf die Aβ-Aggregation, hemmt die Tau-Fehlfaltung und schützt das Gehirn nach traumatischen Hirnverletzungen. Mol Psychiatrie (2023). https://doi.org/10.1038/s41380-023-02101-3

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Eingegangen: 10. Januar 2023

Überarbeitet: 21. April 2023

Angenommen: 02. Mai 2023

Veröffentlicht: 17. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41380-023-02101-3

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