Die Immunisierung gegen Arthropodenprotein beeinträchtigt die Übertragung des Rickettsienerregers von Zecken auf den Wirbeltierwirt

npj Vaccines Band 8, Artikelnummer: 79 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Die durch Anaplasma phagocytophilum verursachte menschliche Anaplasmose ist eine der häufigsten durch Zecken übertragenen Krankheiten in den Vereinigten Staaten. Die schwarzbeinigen Zecken, Ixodes scapularis, übertragen dieses Bakterium auf den Menschen. In dieser Studie liefern wir Beweise dafür, dass die gezielte Behandlung des membrangebundenen organischen Anionentransportpolypeptids 4056 (IsOATP4056) von I. scapularis mit einem Anti-Vektor-Impfstoff die Übertragung von A. phagocytophilum von Zecken auf den Wirbeltierwirt beeinflusst. Anaplasma phagocytophilum induziert die Expression von IsOATP4056 in Zecken und Zeckenzellen. In mit A. phagocytophilum infizierten Zeckenzellen war eine erhöhte Membranlokalisierung von IsOATP4056 erkennbar. Die Behandlung mit einer hohen Dosis (10 µg/ml), aber nicht einer niedrigen Dosis (5 µg/ml) des EL-6-Antikörpers, der auf die größte extrazelluläre Schleife von IsOATP4056 abzielt, zeigte zytotoxische Wirkungen in Zeckenzellen, jedoch nicht in der menschlichen Keratinozyten-Zelllinie (HaCaT). Passive Immunisierung, durch Zecken vermittelte Übertragung und In-vitro-Studien mit Mäusen, die bei zwei kommerziellen Anbietern bestellt wurden, und mit Zeckenzellen zeigten, dass der EL-6-Antikörper nicht nur die Übertragung von A. phagocytophilum von Zecken auf den murinen Wirt beeinträchtigt, sondern auch zur Reduzierung des Virus beiträgt Bakterienlasten in vollgestopften Zecken und in Zeckenzellen durch Aktivierung des Arthropoden-Toll-Signalwegs. Darüber hinaus wurde bei Zecken, die mit EL-6-Antikörper-immunisierten Mäusen gefüttert wurden, eine verringerte Häutungseffizienz festgestellt. Insgesamt stellen diese Ergebnisse einen guten Kandidaten für die Entwicklung eines Anti-Zecken-Impfstoffs dar, der die Übertragung von A. phagocytophilum und möglicherweise anderen durch Zecken übertragenen Krankheitserregern von medizinischer Bedeutung bekämpft.

Durch Zecken übertragene Krankheiten wie Lyme-Borreliose, menschliche Anaplasmose, Ehrlichiose, Rocky-Mountain-Fleckfieber, Tularämie, Powassan-Enzephalitis, durch Zecken übertragene Enzephalitis, Kyasanur-Waldkrankheit und andere stellen weltweit eine große Bedrohung für die menschliche Gesundheit dar1,2,3,4,5 . Die Erreger dieser Krankheiten werden hauptsächlich von Zecken über eine Blutmahlzeit übertragen1,2,4,6,7. Abiotische und biotische Faktoren wie der Klimawandel und die Verfügbarkeit von Reservoirwirten und Zecken könnten zur geografischen Ausbreitung/Verbreitung von Zecken und durch Zecken übertragenen Krankheiten beitragen8,9,10. Herkömmliche Methoden wie der Einsatz von Akariziden zur Eindämmung eines Zeckenbefalls sind in vielen Fällen weniger wirksam11. Daher scheint die Entwicklung von Impfstoffen ein wirksamerer und umweltfreundlicherer Ansatz zur Vorbeugung dieser Krankheiten zu sein.

Die Zulassung des Impfstoffs gegen durch Zecken übertragene Enzephalitis (TICOVAC) liefert den Beweis, dass Impfstoffe die idealen Strategien zur Bekämpfung/Vorbeugung von durch Zecken übertragenen Krankheiten sind12. Es gibt jedoch keine zugelassenen Impfstoffe zur Behandlung/Vorbeugung mehrerer anderer durch Zecken übertragener bakterieller Krankheiten6,13,14. Eine einzelne Zeckenart könnte mehrere menschliche Krankheitserreger übertragen und übertragen15,16,17. Daher sind innovative Strategien, die direkt auf den Zeckenbefall und die Übertragung von Krankheitserregern abzielen, äußerst wünschenswert6,13,18. Mehrere Studien haben hervorgehoben, dass eine Impfung gegen zeckenschützende Antigene die Zeckenfraßaufnahme und/oder die Übertragung von Krankheitserregern verhindern würde6,13,18,19,20,21,22,23,24. Daher sind Studien, die neue konservierte Schutzantigene charakterisieren, wichtig für die Entwicklung eines universellen Anti-Zecken-Impfstoffs, der auf mehrere Zeckenarten abzielt. Ein Anti-Vektor-Impfstoffkandidat gibt Hoffnung, mehr als einen durch denselben Vektor übertragenen Krankheitserreger bekämpfen zu können.

Die menschliche Anaplasmose, die durch das obligat intrazelluläre Bakterium Anaplasma phagocytophilum verursacht wird, ist eine der häufigsten durch Vektoren übertragenen Krankheiten in den Vereinigten Staaten25,26. Zu den klinischen Manifestationen gehören Fieber, Unwohlsein, Kopfschmerzen, Arthralgie, Thrombozytopenie und Leukopenie25. Dieser Erreger wird hauptsächlich durch die schwarzbeinige Zecke Ixodes scapularis übertragen. Diese Zecken durchlaufen vier Phasen in ihrer Entwicklung, die Eier, Larven, Nymphen und erwachsene Stadien umfassen10. Eine Infektion mit A. phagocytophilum führt zu einer Reihe von Ereignissen, die die Signalübertragung des Wirts untergraben und dem Bakterium helfen, sowohl in Säugetieren als auch in Arthropodenvektoren zu persistieren26,27,28,29,30,31,32,33,34. Eine frühere Studie unseres Labors zeigte, dass das organische Anionentransportpolypeptid (OATP) 4056 (IsOATP4056) von I. scapularis während einer Infektion mit A. phagocytophilum hochreguliert wurde35. Darüber hinaus führte die exogene Zugabe des Metaboliten des Tryptophan-Signalwegs, Xanthurensäure (XA), zu Zecken und Zeckenzellen zu einem Anstieg sowohl der Expression von isoatp4056 als auch der Bakterienlast35. Das isoatp4056 ist das einzige OATP unter neun OATPs in Zecken, das während einer A. phagocytophilum-Infektion in den Speicheldrüsen hochreguliert wurde35. Der RNAi-vermittelte Abbau von Isoatp4056 und die Hemmung von OATPs mit einem Inhibitor beeinflussten die bakterielle Replikation in Zecken und Zeckenzellen35. Wir stellten außerdem fest, dass das durch Zecken übertragene Langat-Virus (LGTV) OATPs in Zecken moduliert und die Hemmung dieser Proteine die Viruslast in Zeckenzellen beeinflusst36. Kürzlich haben wir berichtet, dass XA dem Krankheitserreger helfen kann, reaktiven Sauerstoffspezies zu entgehen37. In der Folgestudie berichteten wir, dass A. phagocytophilum die microRNA133 (miR-133) herunterreguliert, die auf isoatp4056-mRNA38 abzielt. Die Überexpression von miR-133 in Zecken beeinträchtigte die Übertragung von A. phagocytophilum von Zecken auf den Wirbeltierwirt, was auf die Bedeutung von IsOATP4056 bei dieser bakteriellen Übertragung schließen lässt38. Wir stellten außerdem fest, dass die Expression von isoatp4056 während der Übertragung von A. phagocytophilum von Zecken auf den Wirbeltierwirt hochreguliert war. Insgesamt liefern diese Studien starke Beweise dafür, dass die gezielte Behandlung von IsOATP4056 eine ideale Strategie sein könnte, um die Übertragung von A. phagocytophilum von Zecken auf den Wirbeltierwirt zu blockieren.

OATPs sind Transmembrantransportproteine, die über mehrere extrazelluläre und intrazelluläre Schleifen verfügen39,40,41,42. Diese Proteine unterstützen die transzelluläre Bewegung verschiedener Hormone, Anionen, Signalmoleküle, Toxine und Wachstumsfaktoren39,40,41,42,43. Basierend auf der bioinformatischen Vorhersage ragt der C-terminale Teil von IsOATP4056 aus der Plasmamembran heraus36, was bei anderen Zecken- oder menschlichen OATPs nicht beobachtet wird. In dieser Studie verwendeten wir zwei affinitätsgereinigte polyklonale Antikörper, die gegen den Extrazellulären Loop-2 (EL-2) und den C-terminalen Extrazellulären Loop-6 (EL-6) gezüchtet wurden, zur Durchführung von In-vitro- und In-vivo-Experimenten. Diese Studie zeigt, dass das Vorhandensein eines Antikörpers gegen EL-6 von IsOATP4056 die Belastung durch A. phagocytophilum sowohl in Zeckenzellen als auch in infizierten Zecken, die mit immunisierten Mäusen gefüttert werden, deutlich reduziert. Darüber hinaus stellten wir fest, dass die passive Immunisierung mit EL-6-Antikörpern die Übertragung von Bakterien von Zecken auf den murinen Wirt reduzierte. Wir zeigen auch, dass das Vorhandensein des EL-6-Antikörpers den TOLL-Signalweg sowohl in Zecken als auch in Zeckenzellen aktiviert und zur Reduzierung der Bakterienlast beiträgt. Diese Studie liefert Belege für die Wirksamkeit des Impfstoffs eines neuen Zeckenschutzantigens zur Bekämpfung der Übertragung von A. phagocytophilum und möglicherweise anderen Krankheitserregern von Zecken auf den Wirbeltierwirt.

In unserer vorherigen Studie haben wir berichtet, dass die Transkripte von Isoapt4056 bei einer Infektion mit A. phagocytophilum bei Zecken signifikant hochreguliert wurden35. Um zu analysieren, ob eine ähnliche Beobachtung auf Proteinebene erkennbar ist, wurden in dieser Studie affinitätsgereinigte polyklonale Antikörper erzeugt, die gegen die Peptide IsOATP4056 Extrazellulärer Loop-2 (EL-2) und Extrazellulärer Loop-6 (EL-6) erzeugt wurden (Abb. 1a). . EL-6 ist die größte Region unter sechs in IsOATP4056 vorhandenen extrazellulären Schleifen (Abb. 1a). Der Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) zeigte eine signifikant (P < 0,05) erhöhte Bindung von EL-2- (Abb. 1b) und EL-6-Antikörpern (Abb. 1c) an die jeweiligen IsOATP4056-Peptide im Vergleich zur bei der Kontrolle festgestellten Bindung Rührpeptid. Darüber hinaus zeigten ELISAs, die mit EL-2- (Abb. 1d) und EL-6-Antikörpern (Abb. 1e) und ganzen Zecken- oder Zeckenzelllysaten durchgeführt wurden, eine signifikant (P < 0,05) erhöhte Expression von IsOATP4056 bei nicht gefütterten, mit A. phagocytophilum infizierten Tieren Nymphenzecken (Abb. 1d und e) und Zeckenzellen (ergänzende Abb. 1a und b) im Vergleich zu den bei nicht infizierten Kontrollen festgestellten Werten. Darüber hinaus ergaben Immunoblot-Analysen mit EL2- oder EL6-Antikörpern in Gegenwart (+) oder Abwesenheit (–) einer Deglykosylierungsmischung im Vergleich zu den festgestellten Werten eine intensive Bande über 250 kDa in Proben, die aus mit A. phagocytophilum infizierten ganzen Zecken oder Zeckenzelllysaten erzeugt wurden bei nicht infizierten Kontrollen unter beiden Bedingungen (Abb. 1f und g). Wir stellten jedoch fest, dass nach der Deglykosylierung und anschließendem Immunblotting mit EL2-Antikörper, jedoch nicht mit EL6-Antikörper, auch in Proben, die aus mit A. phagocytophilum infizierten Zeckenzellen erzeugt wurden, intensive Banden bei ~ 250 kDa und ~ 100 kDa auftraten, im Vergleich zu den bei nicht infizierten Zellen festgestellten Werten Bedienelemente (Abb. 1f und g). In Lysaten, die aus mit A. phagocytophilum infizierten Personen hergestellt wurden, war ein zwei- bis dreifach erhöhter Spiegel an >250-kDa-Banden (unter allen Bedingungen) und ~250-kDa- und ~100-kDa-Banden (im Deglykosylierungszustand, gefolgt von Sondierung mit EL-2-Antikörper) erkennbar Zeckenzellen im Vergleich zu den Werten in Lysaten, die aus nicht infizierten Kontrollen hergestellt wurden (Abb. 1f und g). Darüber hinaus zeigte die mit EL-6-Antikörper durchgeführte Immunfluoreszenzanalyse eine erhöhte IsOATP4056-Färbung in mit A. phagocytophilum infizierten Zeckenzellen im Vergleich zu der Färbung, die bei nicht infizierten Kontrollen festgestellt wurde (Abb. 2). Darüber hinaus wurde festgestellt, dass auf der Plasmamembran von mit A. phagocytophilum infizierten Zeckenzellen erhöhte Konzentrationen von IsOATP4056 lokalisiert waren, verglichen mit den Konzentrationen, die auf den Plasmamembranen nicht infizierter Kontrollen festgestellt wurden (Abb. 2). Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass A. phagocytophilum IsOATP4056 in Zecken und Zeckenzellen hochreguliert und die Lokalisierung dieses Proteins auf der Plasmamembran von Zeckenzellen verbessert.

Es wird eine schematische Darstellung der IsOATP4056-Organisation auf der Plasmamembran von Zeckenzellen gezeigt. Extrazelluläre Schleifen werden mit Zahlen von 1–6 gekennzeichnet. N- und C-terminale Enden sind beschriftet. Es wurden Antikörper gegen Epitope der EL-2- oder EL-6-Region erzeugt. Schaltpläne sind nicht maßstabsgetreu gezeichnet. Dargestellt ist ein ELISA, der mit durcheinandergemischten Peptiden (b und c), EL-2-Peptiden (b) und EL-6-Peptiden (c) durchgeführt wurde und mit EL-2- oder EL-6-Antikörpern sondiert wurde. Dargestellt ist ein ELISA, der mit vollständigen Zeckenlysaten durchgeführt wurde, die aus nicht gefütterten, nicht infizierten oder mit A. phagocytophilum infizierten Nymphenzecken hergestellt wurden und mit EL-2 (d) oder EL-6 (e)-Antikörpern sondiert wurden. Jeder Kreis/jedes Quadrat zeigt Daten an, die aus einer Zecke oder Zeckenzellprobe aus einer Kulturvertiefung generiert wurden. Der p-Wert aus dem Schülertest wird angezeigt. Fehlerbalken zeigen +/− Standardfehler vom Mittelwert an. Gezeigt wird eine Immunoblot-Analyse mit EL-2 (f) oder EL-6 (g)-Antikörpern, die die Konzentrationen von IsOATP4056 in nicht infizierten oder mit A. phagocytophilum infizierten Zecken oder Zeckenzellen in Gegenwart (+) oder Abwesenheit (–) einer Deglykosylierungsmischung zeigt. Der Pfeil zeigt die oligomere Form von IsOATP4056 (>250 kDa). ** gibt die dimere Form von IsOATP4056 (~250 kDa) an und * zeigt die monomere Form von IsOATp4056 (~100 kDa) an. M steht für Marker, UI für nicht infizierte Zecken und I für mit A. phagocytophilum infizierte Zecken oder Zeckenzellen.

Phasenkontrast- oder fluoreszierende mikroskopische Bilder, die die IsOATP4056-Spiegel unter Verwendung des EL-6-Antikörpers (Alexa-594, rot) und die Kernfärbung (blau, DAPI) in nicht infizierten oder mit A. phagocytophilum infizierten Zeckenzellen unter Verwendung des EL-6-Antikörpers zeigen. Zusammengeführte Bilder zeigen eine Überlagerung von IsOATP4056 mit DAPI-Färbung. Das Einfügen in die zusammengeführten Bilder zeigt das Ausblasbild der Zelle, auf die im Vollbild ein Pfeil zeigt. Der Maßstabsbalken zeigt 100 µm an.

Unsere vorherige Studie zeigte, dass die RNAi-vermittelte Unterdrückung der isoatp4056-Expression zu einer verringerten Bakterienbelastung sowohl bei Zecken als auch bei Zeckenzellen führte35. Wir haben nun getestet, ob die Antikörper-vermittelte Blockierung von IsOATP4056 einen ähnlichen Effekt auf die Bakterienbelastung in Zeckenzellen hat (Abb. 3 und ergänzende Abb. 2). Zeckenzellen wurden einen Tag vor der Infektion mit A. phagocytophilum mit 5 µg/ml EL-2- (Ergänzungsabbildung 2) oder EL-6-Antikörper (Abb. 3) behandelt. Die Bakterienbelastung wurde 24 Stunden nach der Infektion überwacht. Die QRT-PCR-Analyse zeigte, dass die Belastung durch A. phagocytophilum bei der Behandlung von Zeckenzellen mit EL-6-Antikörper im Vergleich zu der Belastung bei mit Kontrollantikörpern behandelten Zeckenzellen signifikant verringert wurde (Abb. 3a). Es wurde jedoch kein signifikanter Unterschied in der Bakterienbelastung zwischen mit EL-2-Antikörpern behandelten und mit Kontrollantikörpern behandelten Zeckenzellen festgestellt (ergänzende Abbildung 2). Wir haben kürzlich gezeigt, dass A. phagocytophilum die zirkadiane CLOCK-vermittelte Regulation der angeborenen Immungene von Arthropoden während seiner Übertragung durch Zecken moduliert . Wir haben daher darüber nachgedacht, ob die Beobachtung einer verringerten Bakterienlast bei der Behandlung mit EL-6-Antikörpern mit der Aktivierung von Zeckenimmungenen zusammenhängt. Die QRT-PCR-Analyse ergab, dass die Arthropoden-Toll-Signalweg-Gene myd88 und pelle in mit EL6-Antikörpern behandelten A. phagocytophilum-infizierten Zeckenzellen im Vergleich zu den in der mit Kontrollantikörpern behandelten Gruppe festgestellten Werten signifikant (P < 0,05) hochreguliert waren (Abb . 3g und h). Es war jedoch kein signifikanter Unterschied in der Expression der Gene jak (Abb. 3b), stat (Abb. 3c), pgrp (Abb. 3d), tak (Abb. 3e) und toll (Abb. 3f) zwischen EL-6 erkennbar mit Antikörpern behandelte und mit Kontrollantikörpern behandelte A. phagocytophilum-infizierte Zeckenzellen. Darüber hinaus war kein signifikanter (P > 0,05) Unterschied in der Expression der getesteten Immungene zwischen mit EL-2-Antikörpern behandelten oder mit Kontrollantikörpern behandelten A. phagocytophilum-infizierten Zeckenzellen erkennbar (ergänzende Abbildung 2b-h). Um weiter zu bestätigen, ob der Toll-Weg für die EL6-Antikörper-vermittelte bakterielle Clearance von entscheidender Bedeutung ist, haben wir die myd88-Expression in mit A. phagocytophilum infizierten Zeckenzellen zum Schweigen gebracht (Abb. 3i). Der RNAi-vermittelte Abbau von myd88 in mit A. phagocytophilum infizierten Zeckenzellen führte zu einer signifikant (P < 0,05) erhöhten Bakterienlast (Abb. 3j). Die Behandlung myd88-dsRNA-haltiger A. phagocytophilum-infizierter Zeckenzellen mit EL-6-Antikörper führte jedoch im Vergleich zu den Werten zu einer signifikant (P < 0,05) erhöhten myd88-Expression (Abb. 3k) und einer verringerten Bakterienbelastung (Abb. 3l). in mit Kontrollantikörpern behandelten Zellen festgestellt. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Behandlung mit EL-6-Antikörpern die A. phagocytophilum-Infektion in Zeckenzellen durch Aktivierung des angeborenen Immunwegs der Arthropoden wirksam beseitigt.

QRT-PCR-Analyse, die die Bakterienlast zeigt, analysiert nach p44-Spiegeln (a) und jak (b), stat (c), pgrp (d), tak1 (e), toll (f), myd88 (g) oder pelle (h). ) Expression in Kontroll- oder EL-6-Antikörper-behandelten A. phagocytophilum-infizierten Zeckenzellen. Kontroll- und EL-6-Antikörper wurden in einer Konzentration von 5 µg/ml verwendet. QRT-PCR-Analyse, die das Ausmaß der myd88-Expression (i) oder der Bakterienlast (j) in Schein- oder myd88-dsRNA-behandelten A. phagocytophilum-infizierten Zeckenzellen zeigt. Gezeigt wird die myd88-Expression (k) oder die Bakterienlast (l) in mit Kontroll- oder EL-6-Antikörpern behandelten myd88-dsRNA-haltigen A. phagocytophilum-infizierten Zeckenzellen. Die p44-Spiegel von Anaplasma phagocytophilum wurden auf Zecken-Aktin-Spiegel normalisiert, und die mRNA-Spiegel der angeborenen Immungene von Zecken wurden auf 5,8 S-rRNA-Spiegel von Zecken normalisiert. Der p-Wert aus dem Schülertest wird angezeigt. Fehlerbalken geben +/− Standardfehler des Mittelwerts an. Jeder Kreis stellt Daten dar, die aus der Probe stammen, die aus einer Vertiefung der Zeckenzellkulturplatte entnommen wurde.

Um weiter zu analysieren, ob EL-2- oder EL-6-Antikörper zytotoxische Wirkungen haben, führten wir einen Lebend-/Totzell-basierten Assay wie beschrieben38 mit Zeckenzellen (Abb. 4) und mit menschlichen Keratinozyten-Zelllinien (HaCaT-Zellen) (Abb. 5) durch ). Zecken- (Abb. 4) oder HaCaT-Zellen (Abb. 5) wurden 24 Stunden lang mit 10 µg/ml EL-2- oder EL-6-Antikörpern behandelt und für die Lebend-/Totfärbung und den MTT-Assay verarbeitet. Bei Zeckenzellen, die mit EL-2- oder EL-6-Antikörpern behandelt wurden, wurde im Vergleich zum Zelltod, der bei Behandlung mit Kontrollantikörpern beobachtet wurde, ein erhöhter Zelltod beobachtet (Abb. 4a). Die Quantifizierung anhand mikroskopischer Bilder zeigte im Vergleich zur Kontrolle eine signifikante Anzahl toter Zellen in mit EL-6- und EL-2-Antikörpern behandelten Zeckenzellen (Abb. 4b). Darüber hinaus bestätigte der MTT-Assay eine deutlich verringerte Lebensfähigkeit der Zeckenzellen bei Behandlung mit EL-2- (Abb. 4c) oder EL-6-Antikörpern (Abb. 4d) im Vergleich zur Lebensfähigkeit, die bei mit Kontrollantikörpern behandelten Zellen beobachtet wurde (Abb. 4). Allerdings führte die Behandlung von HaCaT-Zellen mit EL-2- oder EL-6-Antikörpern nicht zu einem erhöhten Zelltod im Vergleich zu dem Zelltod, der bei der Behandlung mit Kontrollantikörpern beobachtet wurde (Abb. 5a). Die Quantifizierung anhand mikroskopischer Bilder zeigte keine Unterschiede in der Anzahl toter Zellen zwischen mit EL-6- und EL-2-Antikörpern behandelten Zeckenzellen im Vergleich zur Kontrolle (Abb. 5b). Der MTT-Assay bestätigte außerdem, dass die Behandlung mit EL-2- (Abb. 5c) oder EL-6-Antikörpern (Abb. 5d) bei HaCaT-Zellen nicht zum Zelltod führte. Die Behandlung von Zeckenzellen mit 5 µg/ml EL-2- oder EL-6-Antikörpern führte zu keinem nennenswerten Zelltod (Ergänzende Abbildungen 3 und 4). Diese Ergebnisse zeigen, dass EL-2- und EL-6-Antikörper nur für Zeckenzellen zytotoxisch sind, nicht jedoch für menschliche Zellen, und dass die Wirkung dieser Antikörper auf den Zelltod dosisabhängig war.

a Phasenkontrast- oder fluoreszierende mikroskopische Bilder, die lebende (grün) oder tote (rot) nicht infizierte Zeckenzellen zeigen. Nicht infizierte Zeckenzellen wurden entweder mit Kontroll- oder EL-2- oder EL-6-Antikörpern in einer Konzentration von 10 µg/ml behandelt. Nach 24 Stunden nach der Behandlung wurden die Zellen für einen Lebend-/Tot-Färbungstest verarbeitet, gefolgt von einer Bildgebung unter einem Fluoreszenzmikroskop. Der Maßstabsbalken zeigt 200 μm an. b Dargestellt ist die Quantifizierung abgestorbener Zellen (rot) aus 5 Bildern. MTT-Assay, der die Lebensfähigkeit von Zeckenzellen nach Behandlung mit Kontrollantikörpern (c und d) oder EL-2-Antikörpern (c) oder EL-6-Antikörpern (d) in einer Konzentration von 10 µg/ml zeigt. Die Y-Achse zeigt den Absorptionswert an, der durch Subtraktion der bei 690 nm gemessenen Absorption von der bei 570 nm gemessenen Absorption erhalten wird. Fehlerbalken geben den +/−Standardfehler des Mittelwerts an. Der p-Wert aus dem Schülertest wird angezeigt.

a Phasenkontrast- oder fluoreszierende mikroskopische Bilder, die lebende (grün) oder tote (rot) nicht infizierte HaCaT-Zellen zeigen. Nicht infizierte HaCaT-Zellen wurden entweder mit Kontroll- oder EL-2- oder EL-6-Antikörpern in einer Konzentration von 10 µg/ml behandelt. 24 Stunden nach der Behandlung wurden die Zellen für einen Lebend-/Tot-Färbungstest verarbeitet, gefolgt von einer Bildgebung unter einem Fluoreszenzmikroskop. Der Maßstabsbalken zeigt 200 μm an. b Dargestellt ist die Quantifizierung abgestorbener Zellen (rot) aus 5 Bildern. MTT-Assay, der die Lebensfähigkeit von HaCaT-Zellen nach Behandlung mit Kontroll- (c und d) oder EL-2- (c) oder EL-6-Antikörpern (d) in einer Konzentration von 10 µg/ml zeigt. Fehlerbalken geben +/− Standardfehler des Mittelwerts an. Der p-Wert aus dem Schülertest wird angezeigt. Die Y-Achse zeigt den Absorptionswert an, der durch Subtraktion der bei 690 nm gemessenen Absorption von der bei 570 nm gemessenen Absorption erhalten wird.

Die Beobachtung einer deutlich verringerten Bakterienbelastung in Zeckenzellen nach der Behandlung mit EL-6-Antikörpern (Abb. 3) veranlasste uns zu untersuchen, ob die passive Immunisierung eines murinen Wirts die Übertragung von A. phagocytophilum von Zecken auf den Wirbeltierwirt während der Blutfütterung beeinflusst. Nach Alter und Hintergrund passende C3H-Mäuse (C3H/HeNHsd und C3H/HeN), die von zwei verschiedenen kommerziellen Anbietern (Envigo bzw. Charles River Laboratories) erhalten wurden, wurden mit Kontrollantikörpern oder EL-2- oder EL-6-Antikörpern in einer Menge von 15 µg/injiziert. Maus (Abb. 6 und ergänzende Abb. 5). 24 Stunden nach der Immunisierung wurden mit A. phagocytophilum infizierte, nicht gefütterte Nymphen (10 Zecken/Maus) mit diesen immunisierten Mäusen gefüttert (Abb. 6a). Die Bakterienbelastung wurde am siebten Tag nach der Zeckenplatzierung im Blut und im Milzgewebe der Maus sowie bei vollgestopften Zecken analysiert (Abb. 6 und ergänzende Abb. 5). Die QRT-PCR-Analyse ergab, dass die Belastung durch A. phagocytophilum im Blut von C3H/HeNHsd (Envigo)-Mäusen (Abb. 6b) und Milzgewebe (Abb. 6c), die aus EL-6-Antikörper-immunisierten Mäusen isoliert wurden, signifikant (P < 0,05) verringert war im Vergleich zur bakteriellen Belastung, die im Mäuseblut (Abb. 6b) und Milzgewebe (Abb. 6c) festgestellt wurde, das aus Kontroll-IgG-immunisierten Mäusen isoliert wurde. Eine ähnliche Beobachtung wurde bei Immunisierungsstudien deutlich, die mit C3H/HeN-Mäusen (Charles River Laboratories) durchgeführt wurden, die mit EL-6-Antikörpern immunisiert waren (Abb. 6d und e). Mit EL-2-Antikörpern durchgeführte Immunisierungsstudien zeigten keine signifikanten Unterschiede in der Bakterienlast zwischen mit EL-2-Antikörpern immunisierten oder mit Kontroll-IgG-Antikörpern immunisierten C3H/HeNHsd-Mäusen (ergänzende Abbildung 5). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Immunisierung mit EL-6-Antikörper die Übertragung von A. phagocytophilum von Zecken auf den murinen Wirt wirksam reduziert.

a Schematische Darstellung, die den Plan für die Immunisierungsstudien zeigt. Am Tag 0 wurden die Mäuse passiv mit Kontroll-, EL-2- oder EL-6-Antikörpern (15 µg/Maus) immunisiert. Am ersten Tag wurden mit A. phagocytophilum infizierte Zecken an immunisierte Mäuse verfüttert. An den Tagen 4–7 wurden gesättigte und vollgestopfte Nymphen gesammelt. Am 8. Tag nach der Immunisierung wurden alle Mäuse eingeschläfert und Blut/Milzgewebe entnommen. QRT-PCR-Analyse zeigt die A. phagocytophilum-Belastung in Kontrollblut oder EL-6-immunisiertem Mäuseblut (b und d) oder Milzgewebe (c und e). Die Immunisierungen wurden an Mäusen durchgeführt, die von Envigo (b und c) oder Charles River Laboratories (d und e) bezogen wurden. Die Bakterienbelastung wurde auf den Aktinspiegel der Maus normalisiert. Jeder Kreis stellt Daten dar, die von einer Mausprobe erhalten wurden. Fehlerbalken geben +/− Standardfehler des Mittelwerts an. Der p-Wert aus dem Schülertest wird angezeigt.

Um die Auswirkung der passiven Immunisierung des murinen Wirts auf die A. phagocytophilum-Belastung innerhalb der Zecke selbst zu bestimmen, wurden Proben von vollgestopften Zecken für PCRs und ELISA verarbeitet (Abb. 7 und ergänzende Abb. 6). ELISA zeigte, dass mit A. phagocytophilum infizierte Nymphen EL-6- (Abb. 7a) und EL-2-Antikörper (ergänzende Abb. 6a) mit der Blutmahlzeit in ihren Körper aufnahmen. Die QRT-PCR-Analyse zeigte, dass die Belastung durch A. phagocytophilum bei Zecken, die mit EL-6-Antikörper-immunisierten Mäusen gefüttert wurden, signifikant (P < 0,05) verringert war, verglichen mit der Belastung, die bei Zecken festgestellt wurde, die mit Kontroll-Antikörper-immunisierten Mäusen gefüttert wurden (Abb. 7b). Es war jedoch kein signifikanter Unterschied in der Bakterienbelastung zwischen mit EL-2-Antikörpern gefütterten Zecken oder mit Kontrollantikörpern immunisierten Mäusen erkennbar (ergänzende Abbildung 6b). Bei Zecken, die mit EL-6-Antikörpern oder mit Kontrollantikörpern immunisierten Mäusen gefüttert wurden, waren keine signifikanten Unterschiede in der Expression von Jak, Stat, Pgrp, Tak1 und Pelle erkennbar (Abb. 7). Allerdings waren die Arthropoden-Mauttranskripte bei Zecken, die mit EL-6-Antikörper-immunisierten Mäusen gefüttert wurden, im Vergleich zu den Werten, die bei Zecken festgestellt wurden, die mit Kontroll-Antikörper-immunisierten Tieren gefüttert wurden, signifikant hochreguliert (Abb. 7g). Darüber hinaus waren, wie bei der bei Zeckenzellen beobachteten Beobachtung, die myd88-Transkripte von Arthropoden bei Zecken, die mit EL-6-Antikörper-immunisierten Mäusen gefüttert wurden, im Vergleich zu den Werten, die bei Zecken beobachtet wurden, die mit Kontroll-Antikörper-immunisierten Tieren gefüttert wurden, signifikant hochreguliert (Abb. 7h). Darüber hinaus beobachteten wir keine signifikanten Unterschiede in der Expression eines der analysierten Arthropoden-Immungene bei Zecken, die mit EL-2-Antikörper-immunisierten Mäusen gefüttert wurden, im Vergleich zu den Werten, die bei Zecken festgestellt wurden, die mit Kontroll-Antikörper-immunisierten Mäusen gefüttert wurden (ergänzende Abbildung 6). ). Zusammenfassend zeigen diese Ergebnisse, dass der EL-6-Antikörper aufgrund der durch Myd88 vermittelten Aktivierung der Arthropoden-Immunwege zu einer Verringerung der Bakterienlast in einer verstopften Zecke führt.

Ein ELISA zeigt das Vorhandensein von EL-6-Antikörpern im Zeckenkörper. QRT-PCR-Analyse zeigt die bakterielle Belastung (b) und die Expression von Jak (c), Stat (d), pgrp (e), tak (f), toll (g), myd88 (h) oder pelle (i) in A. phagocytophilum -infizierte Zecken, die mit Kontrollmäusen oder mit EL-6-Antikörpern immunisierten Mäusen gefüttert wurden. Mäuse wurden mit Kontroll- oder EL-6-Antikörpern in einer Konzentration von 15 µg/Maus immunisiert. Die p44-Spiegel von A. phagocytophilum wurden auf Zecken-Aktin-Spiegel normalisiert, und die mRNA-Spiegel der angeborenen Immungene von Zecken wurden auf 5,8 S-rRNA-Spiegel von Zecken normalisiert. Der p-Wert aus dem Schülertest wird angezeigt. Fehlerbalken geben +/− Standardfehler des Mittelwerts an. Jeder Kreis stellt Daten dar, die aus der Stichprobe stammen, die aus einem Tick generiert wurde.

Die Beobachtung des Absterbens von Zeckenzellen nach Behandlung mit EL-2- oder EL-6-Antikörpern veranlasste uns zu untersuchen, ob diese Antikörper die Häutung von Zecken beeinflussen. Dem alters- und hintergrundangepassten C3H/HeNHsd (Envigo) wurden Kontrollantikörper oder EL-2- oder EL-6-Antikörper in einer Menge von 30 µg/Maus injiziert (Abb. 8a). 24 Stunden nach der Immunisierung wurden naive, nicht gefütterte Nymphen (15 Zecken/Maus) mit diesen immunisierten Mäusen gefüttert (Abb. 8a). Alle vollgestopften Zecken wurden an den Tagen 3–5 nach der Zeckenplatzierung gesammelt. Insgesamt wurden 25, 22 und 11 gefütterte Nymphen von mit Kontrollantikörpern, EL-2- bzw. EL-6-Antikörpern immunisierten Mäusen gesammelt. Diese gefütterten Nymphenzecken wurden zur Häutung in einer Umweltkammer untergebracht (Abb. 8a). Gefütterte Nymphenzecken begannen nach 30-tägiger Inkubation mit der Häutung bis zum Erwachsenenstadium. Wir stellten fest, dass 92 % der Nymphenzecken, die mit Mäusen gefüttert wurden, die mit Kontrollantikörpern immunisiert worden waren, sich zu Erwachsenen häuteten (Abb. 8b). Dagegen häuteten sich 81 % bzw. 63 % der Nymphenzecken, die sich von mit EL-2- bzw. EL-6-Antikörpern immunisierten Mäusen ernährten, zu Erwachsenen (Abb. 8b). Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass die Behandlung mit EL-6-Antikörpern in vitro nicht nur zum Absterben von Zeckenzellen führt, sondern auch die Zeckenhäutung beeinflusst.

a Schematische Darstellung, die den Plan für die Immunisierungsstudien zeigt. Am Tag 0 wurden die Mäuse passiv mit Kontroll-, EL-2- oder EL-6-Antikörpern (30 µg/Maus) immunisiert. Am ersten Tag wurden nicht infizierte Zecken mit immunisierten Mäusen gefüttert. An den Tagen 4–7 wurden gesättigte und vollgestopfte Nymphen gesammelt. Am achten Tag nach der Immunisierung wurden alle Mäuse eingeschläfert. Vollgestopfte Nymphen wurden in einer Klimakammer inkubiert, um den Zecken die Häutung zu ermöglichen. b Histogramm, das den Prozentsatz der Häutungseffizienz von Zecken zeigt, die mit Kontrollmäusen oder mit EL-2- oder EL-6-Antikörpern immunisierten Mäusen gefüttert wurden. Die Anzahl der gemauserten Zecken im Vergleich zur Gesamtzahl, die in dieser Studie analysiert wurde, ist oben in jedem Balken angegeben.

Die Entwicklung eines Anti-Zecken-Impfstoffs gegen Arthropoden-Schutzantigene ist ein innovativer Ansatz auf dem Gebiet der Vakzinologie6,18,22,23,45. Es bietet die Möglichkeit, mehr als einen Krankheitserreger zu bekämpfen, der von derselben Zecke übertragen wird6,18,22,23,45. Anti-Vektor-Impfstoffstrategien zielen darauf ab, die Aufnahme von Krankheitserregern in Zecken oder die Kolonisierung in Zecken oder die Übertragung von Krankheitserregern durch Zecken zu blockieren6,18,22,23,45. In mehreren Studien wurden Impfstoffe getestet oder vorgeschlagen, die auf von Zecken sezernierte, zytosolische oder Membranproteine abzielen6,18,21,22,23,45. In dieser Studie liefern wir Beweise dafür, dass die gezielte Behandlung von IsOATP4056, einem Membrantransportprotein der Zecke, die Übertragung von A. phagocytophilum vom Arthropodenvektor auf den Wirbeltierwirt beeinflusst.

Die Ergebnisse von ELISA, Immunblotting und Immunfluoreszenzanalysen, die erhöhte IsOATP4056-Spiegel in mit A. phagocytophilum infizierten Zecken und Zeckenzellen im Vergleich zu den bei nicht infizierten Kontrollen festgestellten Werten zeigen, stimmen mit den zuvor von unserem Labor veröffentlichten Genexpressionsdaten überein35,37,38 ,46. Basierend auf der primären Aminosäuresequenz beträgt das erwartete Molekulargewicht des Proteins etwa 100 kDa. IsOATP4056 weist mehrere posttranslationale Modifikationsreste auf, einschließlich Glykosylierungsstellen36. Immunoblotting mit EL-2- und EL-6-Antikörpern ohne Deglykosylierungsmischung zeigte eine intensive Bande bei >250 kDa in allen mit A. phaghocytophilum infizierten Zecken- und Zeckenzellproben. Das Vorhandensein einer erhöhten intensiven Bande (nachgewiesen mit EL2-Antikörper) in infizierten Zeckenzellproben > 250 kDa auch nach Deglykosylierung weist darauf hin, dass IsOATP4056 in oligomerisierter Form oder in einer anderen posttranslational modifizierten Form vorliegen könnte. Der Nachweis einer Bande bei etwa 250 kDa weist auf eine Dimerisierung von IsOATp4056 hin, und die Bande bei etwa 100 kDa weist auf eine Monomerform hin. EL-2 und EL-6 sind verschiedene extrazelluläre Schleifen des IsOATP4056-Proteins. Die Deglykosylierung hatte keinen Einfluss auf die Bindung des EL-6-Antikörpers an die oligomerisierte Form oder eine andere posttranslational modifizierte Form von IsOATP4056 (Bande >250 kDa). Wir glauben, dass die Bindungsaffinität für EL-2- und EL-6-Antikörper auf IsOATP4056 unterschiedlich sein könnte. Dabei könnte der EL-6-Antikörper das Epitop in der oligomeren Form von IsOATP4056 leicht erkennen, während der EL-2-Antikörper die oligomere/andere posttranslational modifizierte Form eher erkennen könnte, aber auch die deglykosylierte/dimere/monomere Form von IsOATP4056 erkennen könnte. Die Beobachtung mehrerer Zeckenformen IsOATP4056 steht im Einklang mit der Beobachtung von Säugetier-OATPs, die Dimere/Homo- oder Hetero-Oligomere bilden47,48. Darüber hinaus lässt die Beobachtung mehrerer Banden in Immunoblot-Analysen mit EL-2-Antikörpern darauf schließen, dass IsOATP4056 möglicherweise auch proteolytisch gespalten wird.

In einer kürzlich durchgeführten Studie berichteten wir, dass eine zirkadiane Kontrolle der Immungene des Toll- und JAK/STAT-Signalwegs wie Pelle bzw. Jak für die Übertragung von A. phagocytophilum von Zecken auf den Wirbeltierwirt von entscheidender Bedeutung ist44. In dieser Studie haben wir festgestellt, dass die Aktivierung des Toll-Signalwegs, insbesondere Myd88, für die Bakterienreduktion in Zecken und Zeckenzellen in Gegenwart von EL-6-Antikörpern entscheidend ist. Wenn entweder EL-2- oder EL-6-Antikörper zur Behandlung von Zecken oder Zeckenzellen verwendet wurden, führte nur die Behandlung mit EL-6-Antikörpern zur Aktivierung des Toll/Myd88-Signalwegs, was möglicherweise zu einer Verringerung der Bakterienlast führte. Die Beobachtung einer signifikant erhöhten Bakterienbelastung in mit myd88-dsRNA behandelten Zeckenzellen, gefolgt von der Reduzierung der Bakterien in diesen Zellen nach der Behandlung mit EL-6-Antikörpern, bestätigte die EL-6-vermittelte Aktivierung des Toll-Signalwegs bei der bakteriellen Clearance weiter. IsOATP4056 verfügt über sechs Schleifen, wobei der EL-2-Antikörper an das Epitop der zweiten Schleife und der EL-6-Antikörper an das Epitop der sechsten Schleife bindet. Wir glauben, dass die Bindung des EL-6-Antikörpers an der sechsten Schleife zu einer Störung der Signalübertragung geführt haben könnte, die schließlich zur Aktivierung des Toll-Signalwegs in Zecken führte. Der detaillierte Mechanismus der Aktivierung des Toll-Signalwegs nach der Bindung des EL-6-Antikörpers an IsOATP4056 muss jedoch aufgeklärt werden. In diesem Zusammenhang ist es interessant festzustellen, dass in einer früheren Studie über eine TLR-4-abhängige Herunterregulierung von Maus-OATP-4 bei Behandlung mit LPS49 berichtet wurde.

Die Beobachtung des Zelltods in Zeckenzellen und nicht in HaCaT-Zellen nach Behandlung mit 10 µg/ml EL-2- oder EL-6-Antikörpern legt nahe, dass diese Antikörper spezifisch für Zecken-IsOATP4056 sind. Diese Beobachtung hing jedoch von der Dosis des Antikörpers ab, da bei der Behandlung mit 5 µg/ml kein Zelltod in Zeckenzellen festgestellt wurde. OATPs sind am Transport mehrerer Moleküle beteiligt39,40,41,42,43. Daher ist es nicht überraschend, die Hypothese aufzustellen, dass die Blockierung der extrazellulären Schleifen von IsOATP4056 den Transport verschiedener Moleküle, einschließlich Nährstoffen, beeinflussen könnte, was schließlich zum Zelltod führen könnte. Darüber hinaus unterstützt die Beobachtung einer verringerten Häutung bei Zecken, die mit EL-6-Antikörper-immunisierten Mäusen gefüttert wurden, die These, dass IsOATP4056 für das Überleben der Zeckenzellen von entscheidender Bedeutung ist.

Zecken nehmen Wirtsproteine in einer Blutmahlzeit auf, wenn sie sich von einem Wirbeltier ernähren50. Daher ist die Hypothese berechtigt, dass Zecken auch Antikörper aufnehmen könnten, wenn sie sich von mit EL-6- oder EL-2-Antikörpern immunisierten Mäusen ernähren. Unsere ELISA-Daten zeigen deutlich, dass Zecken mit einer Blutmahlzeit sowohl EL-6- als auch EL-2-Antikörper aufnehmen. Die Verringerung der Bakterienbelastung bei Zecken, die mit EL-6-immunisierten Mäusen gefüttert wurden, deutet darauf hin, dass die gezielte Behandlung von IsOATP4056 auch als idealer therapeutischer Ansatz zur Beeinträchtigung der transstadialen Übertragung von A. phagocytophilum von einem Zeckenentwicklungsstadium zum anderen angesehen werden könnte.

Die Beobachtung einer verringerten Bakterienlast im Blut und Milzgewebe bei Mäusen (von zwei verschiedenen kommerziellen Anbietern), die mit EL-6-Antikörper, aber nicht mit EL-2-Antikörper immunisiert wurden, zeigt deutlich, dass die Blockierung des Arthropoden IsOATP4056 in der EL-6-Region die Übertragung durch A. phagocytophilum beeinträchtigt von Zecken bis zum murinen Wirbeltierwirt. Es sind mehrere Szenarien denkbar, in denen die EL-6-Region eine wichtige Rolle bei der Funktion von IsOATP4056 in Zecken spielen könnte. Erstens könnte EL-6 den Bakterienaustritt aus den Zellen erleichtern und die Blockierung dieser Region könnte die Übertragung durch A. phagocytophilum beeinflussen. Zweitens könnte die EL-6-Region die Signalübertragung des Toll-Signalwegs unterdrücken und die Blockierung dieser Region auf IsOATP4056 könnte den TOLL-Signalweg aktivieren und zu einer Verringerung der Bakterienlast führen. Drittens könnte die EL-6-Region am XA-Transport beteiligt sein. XA ist entscheidend für die Kolonisierung von A. phagocytophilum in Zecken und Zeckenzellen35,37. Daher könnte die Blockierung der EL-6-Region das Überleben und den Austritt von A. phagocytophilum aus Zeckenzellen beeinträchtigen. Unter Berücksichtigung einiger oder aller dieser Hypothesen scheint die Blockierung von IsOATP4056 in der EL-6-Region ein wirksamer Ansatz zu sein, um die Übertragung von A. phagocytophilum von Zecken auf den Wirbelwirt zu beeinträchtigen.

Zusammenfassend liefert diese Studie Hinweise darauf, dass die gezielte Ausrichtung auf den Arthropoden-Membrantransporter IsOATP4056 die Übertragung von A. phagocytophilum von Zecken auf den Wirbeltierwirt beeinflusst. Studien wie diese sind nicht nur wichtig, um die Rolle von Zeckenmolekülen bei Vektor-Erreger-Wechselwirkungen zu verstehen, sondern führen uns auch zur Entwicklung eines Anti-Vektor-Impfstoffs, der die Übertragung von A. phagocytophilum und möglicherweise anderen Krankheitserregern vom medizinisch wichtigen Zeckenvektor auf den Virus angeht Wirbeltierwirt.

In dieser Studie wurde der Anaplasma phagocytophilum-Stamm NCH-1 verwendet. Dieser Stamm wurde von BEI Resources, NIAID, NIH bezogen. Anaplasma phagocytophilum wurde in der menschlichen Promyelozytenzelllinie (HL-60-Zellen) beibehalten, wie in unseren früheren Studien beschrieben35,38,44. Die HL-60-Zelllinie wurde von ATCC, USA, bezogen. Ixodes scapularis-Larven wurden von BEI Resources, NIAID, NIH bezogen. Übertragungsstudien wurden mit gemauserten, nicht gefütterten, mit A. phagocytophilum infizierten Nymphen durchgeführt. In dieser Studie wurde die von ATCC, USA, erhaltene Zeckenzelllinie ISE6 verwendet. Die Zeckenzelllinie wurde wie in unseren vorherigen Studien beschrieben erhalten35,38,44. Die Zeckenaufzucht wurde in einer Umweltkammer von Parameter Generation and Control, USA, durchgeführt. Der Inkubator wurde auf 23 ± 2 °C, 94 % relative Luftfeuchtigkeit und 14:10 Licht:Dunkel-Bedingungen eingestellt.

Die in dieser Studie verwendeten polyklonalen Antikörper IsOATP4056 wurden in einer kommerziellen Einrichtung (GenScript, USA) hergestellt. Die Peptide, die den IsOATP4056-Regionen der extrazellulären Schleifen 2 (NVTRIEDENTCQMP) und 6 mit 3'-Cystein (TWRHKRELKEAPPLC) entsprechen, wurden zur Erzeugung von EL-2- bzw. EL-6-Antikörpern verwendet. Die Antikörper waren sterilfiltriert und enthielten keine Konservierungsstoffe. Nach Erhalt der Antikörper wurden Kontroll-, EL-2- oder EL-6-Antikörper in Wasser gelöst und für Tierversuche verwendet. Das Volumen für 15 oder 30 µg/Maus EL-2- oder EL-6- oder Kontroll-IgG-Antikörperlösungen wurde mit 0,9 % Natriumchlorid auf 100 µl Injektionsvolumen eingestellt.

In dieser Studie wurden C3H/HeN (weibliche Mäuse, 4–6 Wochen alt, CharlesRiver Laboratories, USA) und C3H/HeNHsd (weibliche Mäuse, 4–6 Wochen alt, Envigo) verwendet. B6.129S7-Rag1tm1Mom/J-Mäuse (Jackson Laboratories, USA) wurden zur Aufrechterhaltung einer A. phagocytophilum-Infektion verwendet. Larven von Zecken wurden mit nicht infizierten oder mit A. phagocytophilum infizierten Mäusen gefüttert und zu Nymphen gemausert. Nicht gefütterte, mit A. phagocytophilum infizierte Nymphen wurden mit Kontrollmäusen gefüttert, die mit EL2- oder EL6-Antikörpern immunisiert waren. Kurz gesagt, Gruppen von vier C3H/HeN- oder C3H/HeNHsd-Mäusen wurden einen Tag vor der Platzierung der Zecken 15 µg/Maus Kontroll-, EL-2- oder EL-6-Antikörper injiziert (intraperitoneal, ip). Die schematische Beschreibung des Immunisierungsexperiments wird als Tafel in den Hauptabbildungen bereitgestellt. Einen Tag nach der Immunisierung wurden 10 mit A. phagocytophilum infizierte Zecken an jede immunisierte Maus gefüttert. Verstopfte Zecken wurden nach der Sättigung gesammelt und für RNA-, DNA- oder Proteinextraktionen verarbeitet, um die Genexpression des angeborenen Immunsystems der Zecken, die Bakterienlast und einen ELISA zur Bestimmung der Aufnahme von Antikörpern zu analysieren. Die Mäuse wurden am 7. Tag nach der Zeckenplatzierung (Tag 8 nach der Immunisierung) eingeschläfert und Blut- und Milzgewebe wurden gesammelt und für DNA-Extraktionen verarbeitet, um die Bakterienbelastung zu bewerten. In der zweiten Versuchsreihe wurden Gruppen von jeweils vier C3H/HeNHsd-Mäusen mit Kontroll-EL-2- oder EL-6-Antikörpern (30 µg/Maus) immunisiert und nach dem ersten Tag nach der Immunisierung wurden 15 nicht infizierte Nymphen mit jeder Maus gefüttert. Vollgestopfte Zecken wurden nach der Sättigung gesammelt und in einer Klimakammer inkubiert, um die Häutungseffizienz zu bewerten. Der Prozentsatz der Häutung wurde anhand der Anzahl der gehäuteten erwachsenen Tiere im Verhältnis zur Anzahl der zur Häutung ausgebrüteten Nymphen bestimmt.

Alle Tierversuche in dieser Studie wurden auf der Grundlage des genehmigten Tierprotokolls des University of Tennessee Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) mit der Genehmigungsnummer 2801-0221 durchgeführt. Tierversuche wurden gemäß dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren des National Institute of Health durchgeführt. Um die Belastung der Tiere während der Zeckenfütterung zu minimieren, wurde Acepromazin als Beruhigungsmittel eingesetzt.

Die Zeckenzelllinie ISE 6 wurde in LI5B300-Medium gehalten, wie in unseren früheren Studien beschrieben35,37. Kurz gesagt, einen Tag vor der Infektion wurden 2 × 105 Zellen/Well in Zellkulturplatten ausgesät. Für In-vitro-Zeckenzellinfektionen wurde A. phagocytophilum aus HL-60-Kulturen isoliert, die in IMDM-Medium gehalten wurden. Wirtszellfreies A. phagocytophilum wurde wie beschrieben isoliert30,35,51. Kurz gesagt, A. phagocytophilum-infizierte HL-60-Zellen wurden 10 Minuten lang bei 3005 g zentrifugiert. Zellpellets wurden in IMDM-Medium resuspendiert und 10 Minuten lang in einem Gefrierschrank bei –80 ° C inkubiert, um eine verstärkte Lyse der Zellen zu ermöglichen. Die Zellen wurden 6–8 Mal durch eine 27-Gauge-Spritze geleitet, um die Bakterien freizusetzen. Die Zelltrümmer wurden durch 3-minütige Zentrifugation bei 270 g pelletiert und der Überstand gesammelt. Für In-vitro-Zelllinieninfektionen wurden 2 × 105 /Zeckenzellen/Vertiefung mit A. phagocytophilum infiziert, das aus 4 × 105 infizierten HL-60-Zellen in einer Zellkulturplatte mit 12 Vertiefungen isoliert wurde. Für Antikörperblockierungstests wurden einen Tag vor der Behandlung mit Antikörpern 2 × 105 /Zeckenzellen/Vertiefung ausplattiert. Antikörper (entweder 5 oder 10 µg/ml) wurden in 50 µl sterilem 1x PBS resuspendiert, bevor sie in die Kulturvertiefungen gegeben wurden. 24 Stunden nach der Antikörperbehandlung wurden die Zellen mit A. phagocytophilum infiziert. Zeckenzellen wurden 24 Stunden nach der Infektion gesammelt und für RNA- und DNA-Extraktionen verarbeitet, um die Genexpression bzw. die Bakterienlast zu bewerten.

Das Immunblotting wurde wie beschrieben durchgeführt30. Kurz gesagt, die IsOATP4056-Spiegel wurden in nicht infizierten oder mit A. phagocytophilum infizierten Ganzzecken- oder Zeckenzelllysaten mit polyklonalen Kaninchen-EL-2- und EL-6-Antikörpern analysiert. Proteinlysate, die aus nicht infizierten Zecken oder Zeckenzellen und mit A. phagocytophilum infizierten Zecken oder Zeckenzellen erzeugt wurden, wurden aus demselben Experiment gewonnen und parallel verarbeitet. Es wurde eine SDS-PAGE mit 8 % Auflösungsgel verwendet und das Blotting wurde unter Verwendung von Trans-Blot TurboTM (BioRad, USA) durchgeführt, indem die Parameter auf Spannung – 25 V, Strom – 2,5 A und Zeit – 7 Minuten eingestellt wurden. Geblottete Nitrozellulosemembranen wurden mit 5 % BSA blockiert in TBST (0,05 % Tween 20) für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert und über Nacht in einer primären Antikörperlösung mit einer Verdünnung von 1:1000, hergestellt in 5 % BSA, gelöst in TBST, inkubiert. Vollständige Bilder von Blots/Coomassie-Färbung/Ponceau-Färbung sind in der ergänzenden Abbildung 7 dargestellt. An Meerrettichperoxidase konjugierter Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (Cell Signaling Technologies, USA) wurde in einer Verdünnung von 1:5000 und mit einer Inkubation von 1 verwendet Std. bei Raumtemperatur. Die Chemilumineszenz wurde unter Verwendung des ClarityTM Western ECL-Substrats von BioRad im ChemidocTM MP-Bildgebungssystem (BioRad, USA) gemessen. Die Deglykosylierung von Zeckenzellproben erfolgte mit Protein Deglycosylation Mix II (NEB-P6044S) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Kurz gesagt, 10 µg Zeckenzelllysat wurden mit 0,5 µl Deglykosylierungspuffer 2 gemischt und 10 Minuten bei 75 °C inkubiert. Nach dem Abkühlen wurden die Proben mit 0,5 µl Protein Deglycosylation Mix II gemischt und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt von einer Inkubation bei 37 °C über Nacht und für SDS-PAGE und Immunblotting verarbeitet.

Um die Spezifität von Antikörpern zu bestimmen, die an die jeweiligen Peptide binden, wurden 100 ng EL-2- oder EL-6-Peptide (GenScript, USA) in 1x PBS gelöst und auf die Vertiefungen einer 96-Well-Platte (Nunc, ThermoFisherScientific, USA) aufgetragen. und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Auf ähnliche Weise wurde auch Rührpeptid (GenScript, USA) beschichtet. Als Referenz dienten leere Wells. In ähnlicher Weise wurden 250 ng nicht infizierte oder mit A. phagocytophilum infizierte Zecken oder Zeckenzelllysate auf Platten aufgetragen und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Alle Vertiefungen wurden mit Blockierungspuffer (0,1 % Tween 20 und 1 % BSA in 1x PBS) 1 Stunde lang bei 37 °C blockiert. Nach Auffüllen mit 1x PBS mit 0,05 % Tween 20 und 0,5 % BSA wurden 500 ng Primärantikörper in jede Vertiefung gegeben und 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit Waschpuffer (1x PBS mit 0,05 % Tween 20) wurde mit Meerrettichperoxidase konjugierter Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper in einer Verdünnung von 1:2000 zugegeben und 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert. Nach dreimaligem Waschen wurden 100 µl Peroxidase-Substrat (Sure BlueTM, KPL, USA) zugegeben und 15 Minuten bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurden 50 µl Stopplösung zugegeben und die Absorption bei 450 nm in CYTATION7 (BioTek, USA) gemessen. Zum Nachweis von Antikörpern in gefütterten Zeckennymphen wurden Gesamtproteinlysate von mit EL-2 oder EL-6 gefütterten Zecken oder mit Kontrollantikörpern immunisierten Mäusen in 1x PBS-Puffer mit 1 mM PMSF erzeugt. Fünf Mikrogramm jedes dieser Lysate wurden zu EL-2- oder EL-6-Peptid-beschichteten 96-Well-Platten gegeben. Nach 24-stündiger Inkubation bei 4 °C wurden die Platten zur sekundären Antikörperbehandlung verarbeitet, gefolgt von der Substratzugabe und der Messung der Absorption bei 450 nm.

Die QRT-PCR wurde wie in unseren früheren Veröffentlichungen beschrieben durchgeführt35,44. Die Belastung mit Anaplasma phagocytophilum in Zeckenzellen, gefütterten Nymphenzecken oder Mäuseproben wurde gemessen, indem das Verhältnis der absoluten Menge an bakteriellen p44-Genkopien und der jeweiligen Aktin-Genkopien in Wirtszellen ermittelt wurde. Standardkurven für QRT-PCR für jedes Genfragment wurden beginnend mit 1 ng bis 0,00001 ng/ul erstellt. Die DNA wurde mit dem DNeasy Blut- und Gewebeextraktionskit (QIAGEN, USA) extrahiert. Die Transkriptlasten ausgewählter angeborener Immungene von Zecken wurden als Verhältnisse der absoluten Mengen einzelner Transkripte zu denen der Zecken-5,8-S-rRNA ausgedrückt. Die Gesamt-RNA wurde mit dem Aurum Total RNA Mini-Kit (BioRad, USA) extrahiert und die cDNA wurde mit dem iSCRIPT-cDNA-Synthese-Kit (BioRad, USA) hergestellt. QRT-PCR wurde in CFX Opus 96 (BioRad, USA) unter Verwendung von iQ-SYBR Green Supermix (BioRad, USA) oder 2X Universal SYBR Green fast qPCR Mix (ABclonal, USA) durchgeführt. Im Folgenden sind die Oligonukleotide aufgeführt, die zur Messung des Transkripts von Zecken-pgrp verwendet werden: 5' CGGCTACACGAGACCTTGCT 3' und 5' CGCGACGTGACTGGGGT 3'. Für andere Gene wurden zuvor veröffentlichte Oligonukleotide verwendet35,38,44.

Zeckenzellen (2 × 104) wurden in jede Vertiefung einer 96 schwarzen Platte mit transparentem Boden (Griener Bio One, ThermoFisherScientific, USA) ausplattiert. 24 Stunden nach dem Ausplattieren war eine Gruppe von Zeckenzellen mit A. phagocytophilum infiziert. 24 Stunden nach der Infektion wurden nicht infizierte und mit A. phagocytophilum infizierte Zeckenzellen auf Immunfluoreszenz untersucht. Um IsOATP4056 zu lokalisieren, wurden nicht infizierte oder mit A. phagocytophilum infizierte Zeckenzellen in 4 % Paraformaldehyd fixiert, in 0,2 % Triton X-100 permeabilisiert und mit 3 % BSA blockiert. EL-6-Antikörper wurde in einer Verdünnung von 1:250 verwendet, gefolgt von einer Behandlung mit Anti-Kaninchen-Alexa594-konjugiertem Sekundärantikörper (Molecular Probes, ThermoFisher Scientific, USA) in einer Verdünnung von 1:2500. Die Zellen wurden weiter mit DAPI (Invitrogen, ThermoFisher Scientific, USA) und Bilder wurden mit 40X-Objektiv im CYTATION7-Imager (BioTek, USA) aufgenommen.

Lebend/Tot- und MTT-Assays wurden wie in unseren früheren Veröffentlichungen beschrieben46,52 durchgeführt. Kurz gesagt, 3 × 104 Zeckenzellen wurden in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte (Griener Bio One, ThermoFisherScientific, USA) ausplattiert. Nach einem Tag der Ausplattierung wurden die Zellen mit 5 µg/ml oder 10 µg/ml EL-2- oder EL-6-Antikörpern behandelt. Nach einem Tag der Antikörperbehandlung wurden Zelltodtests durchgeführt. Im Fall des Live/Dead-Assays (LIVE/DEADTM Cell Imaging Kit, Invitrogen) wurde der Inhalt der grünen und roten Fläschchen gemäß den Anweisungen gemischt und dem Kulturmedium in ¼ Verdünnung zugesetzt. Nach 15-minütiger Inkubation wurden die Zellen mit einem 20-fachen Objektiv im CYTATION7-Imager (BioTek, USA) auf Fluoreszenz abgebildet. Im Falle des MTT-Assays wurden den Zellen 5 mg/ml MTT-Reagens (Sigma, USA) in 1x PBS in einer Menge von 10 % des Gesamtvolumens zugesetzt. Die Platten wurden 4 Stunden lang bei 37 °C inkubiert und DMSO wurde mit der Hälfte des Volumens des Kulturmediums zugegeben. Nach 5-minütigem Mischen wurde die Extinktion bei 570 nm und 690 nm gemessen. Die Werte bei 690 nm wurden von den jeweiligen Werten bei 570 nm abgezogen und Diagramme erstellt.

Die Schein- oder myd88-dsRNA-Synthese wurde wie beschrieben durchgeführt35,38. Kurz gesagt, das myd88-dsRNA-Fragment wurde durch PCR unter Verwendung von 5' CCAGATCTGTCCATCAAGAGCAGTGGCA 3' und 5' CGGGTACCACCATTGTGAAGGAGCACCA 3' mit BglII- bzw. KpnI-Stellen erzeugt. Das erhaltene PCR-Produkt wurde wie beschrieben in den pL4440-Doppel-T7-Script-II-Vektor kloniert29,30. Der erhaltene Klon wurde später für die dsRNA-Synthese unter Verwendung des MEGAscript RNAi Kit (Ambion Inc.) gemäß den Anweisungen des Herstellers verarbeitet. Die Transfektion von myd88-dsRNA in ISE6-Zeckenzellen wurde mit 2 Mikroliter FuGENE 6-Transfektionsreagenz (Promega, USA) wie beschrieben durchgeführt35,38. Kurz gesagt wurden 2 × 105 Zellen in einer Platte mit 12 Vertiefungen in L15B300-Medium ausplattiert. Nach der Inkubation über Nacht wurden 750 ng myd88-dsRNA mit FuGENE 6-Transfektionsreagenz gemischt und in jede Vertiefung gegeben. Nach 4 Stunden wurde 2x L15B300-Medium mit oder ohne EL-6-Antikörper hinzugefügt und über Nacht inkubiert. Nach der Inkubation wurde zellfreies A. phagocytophilum hinzugefügt und die Proben wurden 24 Stunden nach der Infektion gesammelt. Die Proben wurden zur RNA- und DNA-Extraktion verarbeitet, um die myd88-Expression bzw. die Bakterienlast zu quantifizieren.

Alle Datensätze wurden statistisch mit der GraphPad Prism 5-Software (www.graphpad.com) analysiert. Der nicht gepaarte Student-t-Test wurde in Betracht gezogen, um die experimentellen Datensätze mit zwei Variablen zu vergleichen. p-Werte von <0,05 gelten als signifikant.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel (und seinen ergänzenden Informationsdateien) enthalten.

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Die folgenden Reagenzien wurden von BEI Resources, NIAID, NIH erhalten: Ixodes scapularis Larvae (Live), NR-44115 und Anaplasma phagocytophilum, Stamm NCH1, NR-48807. Diese Studie wurde durch Mittel des National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID), der National Institutes of Health (NIH) (Preisnummer: R01AI130116) an GN und der University of Tennessee, Knoxville an HS und GN unterstützt.

Abteilung für biomedizinische und diagnostische Wissenschaften, College of Veterinary Medicine, University of Tennessee, Knoxville, TN, USA

PP Mahesh, Prachi Namjoshi, Hameeda Sultana und Girish Neelakanta

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PPM, PN und GN führten die Experimente durch. PPM, PN, HS und GN analysierten die Daten. PPM, HS und GN haben die Studie entworfen, HS und GN stellten Reagenzien zur Verfügung. Alle Autoren haben das Manuskript gelesen, bearbeitet und genehmigt. PPM und GN haben den Artikel geschrieben. GN konzipierte und konzipierte die Studie und betreute die Gesamtuntersuchungen.

Korrespondenz mit Girish Neelakanta.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Mahesh, PP, Namjoshi, P., Sultana, H. et al. Die Immunisierung gegen Arthropodenprotein beeinträchtigt die Übertragung des Rickettsien-Erregers von Zecken auf den Wirbeltierwirt. npj Vaccines 8, 79 (2023). https://doi.org/10.1038/s41541-023-00678-y

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Eingegangen: 16. September 2022

Angenommen: 16. Mai 2023

Veröffentlicht: 30. Mai 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41541-023-00678-y

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