Translationale Regulation und Protein

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 616 (2023) Diesen Artikel zitieren

1 Altmetrisch

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TREM2 ist ein Transmembranrezeptor, der in Mikroglia und Makrophagen exprimiert wird. Erhöhte TREM2-Spiegel in diesen Zellen werden mit altersbedingten pathologischen Zuständen, einschließlich der Alzheimer-Krankheit, in Verbindung gebracht. Der regulatorische Mechanismus, der der Proteinexpression von TREM2 zugrunde liegt, bleibt jedoch unklar. In dieser Studie decken wir die Rolle der 5′-untranslatierten Region (5′-UTR) von menschlichem TREM2 bei der Translation auf. Ein Upstream-Startcodon (uAUG) in der 5′-UTR von TREM2 ist für einige Primaten, einschließlich Menschen, spezifisch. Die Expression des herkömmlichen TREM2-Proteins, ausgehend vom stromabwärts gelegenen AUG (dTREM2), wird durch die 5′-UTR auf uAUG-vermittelte Weise unterdrückt. Wir entdecken auch eine TREM2-Protein-Isoform ausgehend von uAUG (uTREM2), die größtenteils durch Proteasomen abgebaut wird. Schließlich ist die 5′-UTR für die Herunterregulierung der dTREM2-Expression als Reaktion auf Aminosäuremangel essentiell. Insgesamt identifiziert unsere Studie eine artspezifische regulatorische Rolle des 5′-UTR bei der TREM2-Translation.

Der auf myeloiden Zellen exprimierte Triggering-Rezeptor 2 (TREM2) ist ein Transmembranprotein, das als Lipid-empfindlicher Rezeptor fungiert1. TREM2 wird überwiegend in Mikroglia im Gehirn exprimiert. Darüber hinaus ist es an der mikroglialen Phagozytose, dem synaptischen Beschneiden und der Entzündungsreaktion2,3,4 beteiligt. Seltene Varianten von TREM2 erhöhen nachweislich das Risiko für die Alzheimer-Krankheit (AD)5,6. Darüber hinaus führen homozygote Mutationen in TREM2 zur Nasu-Hakola-Krankheit, einer seltenen Krankheit, die durch früh einsetzende Demenz und Knochenzysten gekennzeichnet ist7. Krankheitsassoziierte Varianten von TREM2 beeinträchtigen die substratspezifischen Funktionen und das Überleben von Mikroglia8. Im Gegensatz dazu rettet die erhöhte Expression von TREM2 oder die Antikörper-vermittelte Aktivierung von TREM2 einige Krankheitsphänotypen in AD-Modellmäusen9,10. TREM2 ist essentiell für den Übergang von homöostatischen Mikroglia zu einem krankheitsassoziierten Mikroglia-Zustand11. Seine Expression markiert auch Tumor-assoziierte Makrophagen und Lipid-assoziierte Makrophagen12,13. Daher wurde TREM2 mit altersbedingten Erkrankungen in Verbindung gebracht, darunter AD9,10,11, Krebs12 und Fettleibigkeit13. Obwohl die zellulären Funktionen von TREM2 nachgewiesen wurden, ist der Regulierungsmechanismus von TREM2 noch unklar.

Das geeignete Expressionsniveau von Proteinen wird durch nicht-kodierende Elemente bestimmt, wie beispielsweise die 5′-untranslatierte Region (UTR)14. Upstream AUG (uAUG) ist ein evolutionär konserviertes Merkmal der 5'-UTR zwischen Menschen und Nagetieren15. uAUG unterdrückt die Expression des Proteins, das vom nachgeschalteten Haupt-ORF (offener Leserahmen) stammt, indem es das Scannen von Ribosomen unterbricht oder einen Nonsense-vermittelten mRNA-Zerfall induziert16. Genetische und bioinformatische Studien haben geschätzt, dass etwa 60 % aller proteinkodierenden Gene des Menschen uAUG17 enthalten.

Hier berichten wir über die Rolle von uAUG in der 5′-UTR von TREM2, die sich stromaufwärts des stromabwärts gelegenen AUG (dAUG) befindet. Interessanterweise wurde festgestellt, dass uAUG bei Primaten konserviert ist, nicht jedoch bei Mäusen. Es wurde festgestellt, dass die 5′-UTR von menschlichem TREM2 die Expression von herkömmlichem, aus dAUG translatiertem TREM2 (bezeichnet als dTREM2) in uAUG-abhängiger Weise unterdrückt. Darüber hinaus haben wir eine vom uAUG abgeleitete TREM2-Isoform entdeckt. Unsere Studie zeigt die artabhängige Rolle des 5′-UTR bei der TREM2-Translation.

Ein Sequenzvergleich ergab das Vorhandensein eines uAUG, das sich 90 Basen stromaufwärts des dAUG in der 5'-UTR von TREM2 bei den meisten Primatenarten, einschließlich Menschen, befindet, jedoch nicht bei anderen Säugetieren, wie z. B. Mäusen (Abb. 1a, ergänzende Abb. 1). Im Folgenden bezeichnen wir die 90-Basen-Region stromaufwärts von dAUG der Einfachheit halber als 5′-UTR. Ribosomen-Profilierungsdatensätze18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37,38 legen nahe, dass Ribosomen die erste Hälfte erkennen des 5'-UTR von menschlichem TREM2, jedoch nicht der entsprechenden Region von Maus-Trem2 (ergänzende Abbildung 2a, ergänzende Tabelle 1). Wir untersuchten die relative Nutzung von uAUG im Vergleich zu dAUG durch Ribosomen mithilfe eines Ribo-Seq-Datensatzes und stellten fest, dass die Erkennung von uAUG durch Ribosomen etwa 30 % der Erkennung von dAUG betrug (ergänzende Abbildung 2b). Obwohl der Zelltyp unterschiedlich war, deutete eine ähnliche Analyse von Maus-Mikroglia40 auf einen geringeren Anteil (~ 5 %) des an Ribosom gebundenen Trem2 5'-UTR hin (ergänzende Abbildung 2b). Wir stellten daher die Hypothese auf, dass uAUG die Translation von dTREM2 beeinflusst. Wir haben Expressionsvektoren hergestellt, in denen 90 Basen lange Sequenzen stromaufwärts vom dAUG verschiedener Spezies mit der kodierenden Sequenz (CDS) von menschlichem TREM2 fusioniert wurden (Abb. 1b). Die 5'-UTR von menschlichem TREM2 verringerte die Expression von dTREM2 signifikant im Vergleich zu dem Konstrukt, dem die 5'-UTR von TREM2 fehlt (Abb. 1c, d). Im Gegensatz dazu wurde keine solche Abnahme von dTREM2 beobachtet, wenn der 5'-UTR der Maus mit diesem Gen fusioniert wurde (Abb. 1c, d). Unterdessen zeigte die 5′-UTR von Schimpansen und Weißbüschelaffen mittelmäßige Effekte. Bemerkenswerterweise wurde eine Proteinbande entdeckt, die größer als die von dTREM2 war, als die 5'-UTR von Primaten mit diesem Gen fusioniert wurde (Abb. 1c, als uTREM2 bezeichnet). Es wird vorausgesagt, dass die Translation von uAUG eine TREM2-Isoform mit einer Verlängerung von 30 Aminosäureresten erzeugt, die am N-Terminus von dTREM2 hinzugefügt wird. Diese Daten legen nahe, dass uAUG zwei Rollen spielt: die Unterdrückung der Expression von dTREM2 und die Produktion von uTREM2.

ein RNA-Sequenzvergleich von 90 Basen stromaufwärts von stromabwärts gelegenem AUG (dAUG). uAUG und dAUG werden grün bzw. grau hervorgehoben. Der Basenaustausch ist in Magenta markiert. b Schematische Darstellung chimärer Konstrukte des menschlichen TREM2-CDS, fusioniert mit der 90-Basen-Sequenz vor dem dAUG jeder Spezies. c Ergebnisse des Western Blot unter Verwendung von HEK293-Zellen, die mit jedem chimären Konstrukt transfiziert wurden. Der rote Pfeil zeigt die Proteinbande von uTREM2. d Quantitative Analyse der TREM2-Proteinexpression in c. Die Ergebnisse des Tukey-Tests werden angezeigt. Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± SD dar (n = 4).

Um die Rolle von uAUG weiter aufzuklären, haben wir mithilfe des HEK293-basierten Flp-In-Systems isogene Zelllinien etabliert, um ein menschliches TREM2-Minigen in voller Länge stabil zu exprimieren, das den 5′-UTR enthält, in dem uAUG und/oder dAUG mutiert waren ( Abb. 2a). Die Western-Blot-Analyse der gesamten Zelllysate zeigte eine Abnahme des von der 5'-UTR-WT-Zelllinie stammenden dTREM2 im Vergleich zu dem von 5'-UTR-none (Abb. 2b, c). Im Gegensatz dazu war das Expressionsniveau von dTREM2, das von 5'-UTR-Mu stammte, mit dem von 5'-UTR-none abgeleiteten vergleichbar (Abb. 2b, c). In den Zelllinien 5'-UTR-Md und 5'-UTR-Mud wurden keine TREM2-Proteinbanden beobachtet (Abb. 2b). Somit wurde das Expressionsniveau des dTREM2-Proteins in uAUG-abhängiger Weise reguliert, wohingegen TREM2-mRNA, die von 5'-UTR-WT, 5'-UTR-Md und 5'-UTR-Mud stammte, im Vergleich keine Verringerung zeigte auf das Niveau von 5′-UTR-keine (Abb. 2d). Daher ist uAUG für die Unterdrückung von dTREM2 durch die 5'-UTR auf Translationsebene wesentlich.

a Schematische Darstellung einer Reihe von fl-TREM2-Minigenkonstrukten mit oder ohne 5′-UTR (nicht translatierte Region). Mutierte Startcodons werden rot angezeigt. HEK293-Zellen, die diese Minigene stabil exprimieren, wurden mithilfe des Flp-In-Systems etabliert. b Die gesamten Zelllysate jeder stabilen Zelllinie wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und mit einem Anti-TREM2-Antikörper untersucht. c Quantifizierung der Western-Blot-Ergebnisse. Die Daten stellen den Mittelwert ± SD dar (n = 3, Tukey-Test). d TREM2-mRNA-Spiegel in jeder Zelllinie normalisiert auf ACTB. Fehlerbalken geben den Mittelwert ± SD an (n = 3, Tukey-Test). Es wurden keine signifikanten Unterschiede zwischen den 5'-UTR-keinen und 5'-UTR-WT-Zellen festgestellt.

Wie in Abb. 2b gezeigt, konnte uTREM2 in den gesamten Zelllysaten von 5′-UTR-WT- und 5′-UTR-Md-Zellen kaum nachgewiesen werden. Anschließend untersuchten wir die optimalen Bedingungen für den Nachweis der uTREM2-Expression. Die Verwendung von 0,1 % Triton-X-100 zur Zelllyse und eines Antikörpers gegen den C-Terminus von TREM2 zum Immunblotting erleichterte den Nachweis der Proteinbande, die uTREM2 in den 5′-UTR-WT-Zellen entspricht (roter Pfeil, ergänzende Abb . 3). Darüber hinaus wurde uTREM2 bei Verwendung der membrangebundenen Proteinfraktion eindeutig nachgewiesen (Abb. 3a). THP-1-Zellen produzierten nur dann eine Proteinbande von endogenem uTREM2, wenn diese Zellen mit Phorbol-Myristat-Acetat (PMA) behandelt wurden (ergänzende Abbildung 3). Die uTREM2-Bande wurde in der membrangebundenen Proteinfraktion von 5'-UTR-WT nachgewiesen, jedoch nicht in den anderen Zellen (Abb. 3a).

a Membrangebundene Proteinfraktionen stabiler Zelllinien wurden einer Western-Blot-Analyse unterzogen. Der rote Pfeil zeigt die Proteinbande von uTREM2. Als Ladekontrolle wurde APP verwendet. b Schema der Immunpräzipitation und PNGase-F-Behandlung. c Immunpräzipitation mit Anti-TREM2-Antikörpern in den angegebenen Zellen. Die roten Pfeile zeigen uTREM2 an. d 5′-UTR (untranslatierte Region)-keine, 5′-UTR-WT-, 5′-UTR-Mu- und 5′-UTR-Md-Zellen wurden einer Immunpräzipitation unterzogen, gefolgt von einer Deglykosylierung mit PNGase F. e TREM2, exprimiert in THP -1-Zellen wurden immunpräzipitiert und anschließend mit PNGase F behandelt. Rote und blaue Pfeile zeigen die Proteinbande von uTREM2 bzw. deglykosyliertem uTREM2 an (d, e).

Um die Integrität von uTREM2 zu untersuchen, wurden 5'-UTR-none-, 5'-UTR-WT- und THP-1-Zellen mit einem Antikörper gegen die Ektodomäne von dTREM2 immunpräzipitiert und mit einem anderen Antikörper gegen seinen C-Terminus untersucht (Abb. 3b). ). Sowohl 5′-UTR-WT- als auch THP-1-Zellen führten zu einer Proteinbande von uTREM2 in der immunpräzipitierten Fraktion (rote Pfeile, Abb. 3c). Dies deutete auch darauf hin, dass uTREM2 Ektodomänen- und C-terminale Sequenzen mit dTREM2 teilt. Um zu bestätigen, ob uTREM2 spezifische N-terminale Peptide enthält, wurde die Proteinbande von uTREM2 aus den 5′-UTR-Zellen nach der Immunpräzipitation einer Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie-Analyse (LC-MS/MS) unterzogen. Infolgedessen haben wir ein Peptid, MPDPLFSAVQGK, entdeckt, das dem einzigartigen N-Terminus von uTREM2 entsprach (ergänzende Abbildung 4), was unsere Hypothese stützt, dass die Translation von uAUG zur Produktion von uTREM2-Protein führt.

TREM2 unterliegt einer Glykosylierung als posttranslationale Modifikation41. Um zu überprüfen, ob uTREM2 glykosyliert war, wurden die von unseren stabilen Zelllinien abgeleiteten immunpräzipitierten Produkte mit PNGase F deglykosyliert (Abb. 3b). In Abwesenheit von PNGase F zeigten Immunpräzipitate sowohl von 5'-UTR-WT- als auch von 5'-UTR-Md-Zellen eine Proteinbande von uTREM2 (rote Pfeile, Abb. 3d). Somit wurde uTREM2 in den 5′-UTR-Md-Zellen exprimiert, und der fehlende Nachweis in früheren Experimenten könnte auf den niedrigen uTREM2-Spiegel zurückzuführen sein. Nach der Behandlung mit PNGase F zeigten sowohl 5'-UTR-none als auch 5'-UTR-Mu ähnliche Muster (Abb. 3d). Bemerkenswerterweise wurde in den 5′-UTR-WT- und 5′-UTR-Md-Zellen eine einzigartige Proteinbande nachgewiesen, die in den 5′-UTR-none- und 5′-UTR-Mu-Zellen fehlte und von der stammen sollte uAUG (Abb. 3d, angezeigt durch blaue Pfeile), was bedeutet, dass uTREM2 einer Glykosylierung unterzogen wird (Abb. 3d). Darüber hinaus zeigten THP-1-Zellen ein ähnliches Proteinbandenmuster wie 5′-UTR-WT (Abb. 3e). Diese Ergebnisse legen nahe, dass uTREM2 glykosyliert ist.

Um zu überprüfen, ob uTREM2 von uAUG übersetzt wird, haben wir eine Reihe mutierter fl-TREM2-Minigene mit einem Stoppcodon im 5'-UTR vorbereitet (Abb. 4a). Da uAUG das erste Codon von uTREM2 ist, wurde die Substitution, die das 6. und 23. Codon von uAUG umfasst, als F6X bzw. C23X bezeichnet. Die Proteinbande von uTREM2 wurde sowohl im 5'-UTR-WT-F6X- als auch im 5'-UTR-WT-C23X-Minigen abgeschafft (rote Pfeile, Abb. 4b). Gleichzeitig wurde mit diesen Konstrukten das Expressionsniveau von dTREM2 teilweise wiederhergestellt, was darauf hindeutet, dass eine kontinuierliche Translation von uAUG zu dAUG für die repressive Regulierung der TREM2-Translation erforderlich ist. Der Gehalt an dTREM2-Protein, der aus den Minigenen 5'-UTR-Mu-F6X und 5'-UTR-WT-C23X stammte, war mit dem des Minigens 5'-UTR-Mu vergleichbar (Abb. 4b). Darüber hinaus wurden Proteinbanden sowohl von uTREM2 als auch von dTREM2 mit dem 5′-UTR-Md-Minigen nachgewiesen; Mit den Minigenen 5'-UTR-Md-F6X und 5'-UTR-Md-C23X wurde jedoch keine Proteinbande nachgewiesen (Abb. 4b). Dies weist stark darauf hin, dass beide Banden von der uAUG-initiierten Translation des 5′-UTR-Md-Minigens abgeleitet wurden.

a Blaue Linien stellen Stoppcodons dar, die zwischen uAUG und stromabwärts gelegenem AUG (dAUG) eingeführt wurden. F6X und C23X stellen Stoppcodons dar, die in die 5′-UTR (untranslatierte Region) von TREM2 eingeführt wurden. b Membrangebundene Fraktionen von HEK293-Zellen, die mit diesen Minigenen transfiziert wurden, wurden durch Western Blot analysiert. Als Ladekontrolle wurde APP verwendet. Die roten Pfeile zeigen uTREM2 an. c Schematische Darstellung von Frameshift-Mutanten. Eine Rasterverschiebung in Minigenen wurde durch eine einzelne Nukleotidinsertion in der Mitte der 5′-UTR induziert. d Membranfraktionen von HEK293-Zellen, die mit Frameshift-Minigenen transfiziert waren, wurden einer Western-Blot-Analyse unter Verwendung eines Anti-TREM2-Antikörpers unterzogen.

Wir haben auch ein Minigen voller Länge mit einem 5'-UTR hergestellt, in dem durch eine Einzelnukleotidinsertion ein Frameshift eingeführt wurde (Abb. 4c, als FS bezeichnet). Die Expression von uTREM2 wurde auch durch das 5'-UTR-WT-FS-Minigen gestört (Abb. 4d). Bemerkenswerterweise war das Expressionsniveau von dTREM2, das von 5'-UTR-WT-FS stammte, mit dem von 5'-UTR-WT vergleichbar (Abb. 4d), was darauf hinweist, dass die Frameshift-Mutation die dTREM2-Expression nicht erhöhte. Dies stand im Gegensatz zur obigen Beobachtung (Abb. 4b), bei der dTREM2 von 5'-UTR-WT durch Einführung von Punktmutationen (F6X oder C23X) erhöht wurde. Diese Beobachtungen stehen im Einklang mit der Tatsache, dass eine kontinuierliche Translation von uAUG, die durch dAUG verläuft, zur Unterdrückung von dTREM2 beitragen könnte. Die Proteinbanden von uTREM2 und dTREM2 wurden mit dem 5'-UTR-Md-FS-Minigen aufgehoben (Abb. 4d). Zusammen mit der in Abb. 4b gezeigten Beobachtung lassen diese Ergebnisse die Möglichkeit vermuten, dass uTREM2 teilweise am Signalpeptid verdaut wird und das dTREM2-Protein produziert. Es gab keinen Unterschied in der intrazellulären Lokalisierung von TREM2 zwischen diesen Mutanten (ergänzende Abbildung 5).

Als nächstes untersuchten wir die Bedeutung der 5'-UTR von TREM2 in der Zellphysiologie, indem wir die Reaktion der TREM2-Expression auf zellulären Stress verglichen (Abb. 5a, ergänzende Abb. 6a). Die in dieser Studie getesteten zellulären Stressbedingungen waren wie folgt: (i) Aminosäuremangel; (ii) Bafilomycin A1 (BafA1), ein vakuolärer H + -ATPase-Inhibitor; (iii) ein Proteasom-Inhibitor, MG132; (iv) Polyinosin-Polycytidylsäure (polyI:C), ein synthetisches Analogon doppelsträngiger RNA (dsRNA); und (v) Lipopolysaccharid (LPS), ein Entzündungsmediator. Das Expressionsniveau von dTREM2, das aus den 5'-UTR-Non-Zellen stammt, wurde unter den untersuchten Bedingungen nicht verändert (Abb. 5b). Interessanterweise erschien speziell in den 5'-UTR-WT-Zellen mit MG132-Behandlung eine Bande, die etwas kleiner als dTREM2 war (Abb. 5a), was auf das Vorhandensein eines von 5'-UTR abgeleiteten TREM2-Proteins schließen lässt, das vom Proteasom gründlich abgebaut wurde. Darüber hinaus wurde das Expressionsniveau von dTREM2 in 5'-UTR-WT-Zellen durch Aminosäuremangel und PolyI: C-Behandlung signifikant verringert (Abb. 5a, c). Die Behandlung mit BafA1 und LPS veränderte die Expressionsniveaus von TREM2 nicht (Abb. 5a, c). Die gleichzeitige Behandlung mit Aminosäuremangel und BafA1 verringerte jedoch das Expressionsniveau von dTREM2 im 5'-UTR-WT (Abb. 5d), was zeigt, dass die durch Aminosäuremangel vermittelte Verringerung von dTREM2 nicht auf einen verstärkten Abbau durch Autophagie zurückzuführen war. Das Expressionsniveau von dTREM2 in 5'-UTR-Mu-Zellen wurde durch Aminosäuremangel nicht verändert, wohingegen das in 5'-UTR-Md-Zellen verringert war (Abb. 5e), was darauf hinweist, dass uAUG für die Herunterregulierung beider uTREM2 wesentlich ist und dTREM2, vermittelt durch Aminosäuremangel. Das endogene dTREM2-Protein in THP-1-Zellen zeigte eine ähnliche Herunterregulierung bei Aminosäuremangel (ergänzende Abbildung 6b). Schließlich analysierten wir die intrazelluläre Lokalisierung von TREM2 durch Immunfluoreszenz. Während das TREM2-Signal der 5'-UTR-none- und 5'-UTR-Mu-Zelllinien erhalten wurde, war das der 5'-UTR-WT- und 5'-UTR-Md-Zellen nahezu nicht nachweisbar (ergänzende Abbildung 7). . Wir exprimierten daher vorübergehend TREM2-Minigene und beobachteten die TREM2-Lokalisierung. Obwohl die TREM2-Expression in mit 5'-UTR-Md transfizierten Zellen immer noch gering war, war das Lokalisierungsmuster bei allen vier Konstrukten ähnlich, wobei durch unterschiedliche Behandlungen nur geringe Änderungen hervorgerufen wurden (ergänzende Abbildung 8).

a Die 5′-UTR-none- und WT-Zelllinien waren zellulärem Stress ausgesetzt. Die Fraktionen der membrangebundenen Proteine ​​wurden einem Western Blot unter Verwendung der angegebenen Antikörper unterzogen. Der rote Pfeil zeigt uTREM2 (TREM2-Protein-Isoform ab stromaufwärts gelegenem AUG). b, c Quantifizierung von Downstream-TREM2 (dTREM2) aus 5′-UTR-keinen Zellen (b) und 5′-UTR-WT-Zellen (c) basierend auf den Western-Blot-Ergebnissen. Unterschiede zur unbehandelten Kontrolle wurden mit dem Dunnett-Test analysiert. Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± SD dar (n = 4). d, e Stabile Zelllinien wurden in einem Hungermedium mit Bafilomycin A1 kultiviert. Gesamtzelllysate wurden verwendet, um die Wirkung der Behandlung zu bestätigen.

Wie in Abb. 5a gezeigt, führte die MG132-Behandlung zu einer Bande, die etwas kleiner als dTREM2 in 5'-UTR-WT-Zellen, jedoch nicht in 5'-UTR-keinen Zellen war. Diese Bande wurde auch in 5'-UTR-Md-Zellen nach MG132-Behandlung nachgewiesen (Abb. 6a), was stark darauf hindeutet, dass sie von uAUG stammt. Eine ähnliche Bande wurde in der Membranfraktion von MG132-behandelten THP-1-Zellen nachgewiesen, wenn auch in geringerem Ausmaß (Abb. 6b). Somit scheint es, dass die Mehrheit der von uAUG abgeleiteten Produkte durch Proteasomen abgebaut wird.

a Gesamtzelllysate stabiler Zelllinien wurden mit MG132 behandelt und durch Western Blot analysiert. Ubiquitin (Ub) wurde als Positivkontrolle für die MG132-Behandlung verwendet. Rote und blaue Pfeile zeigen die Proteinbande von intaktem uTREM2 bzw. einer Proteasom-sensitiven Form von uTREM2 an. b Western-Blot-Analyse der membrangebundenen Proteinfraktion von MG132-behandelten Zellen. c Arbeitshypothese der Verarbeitung von uTREM2 (TREM2-Protein-Isoform ab uAUG). Ein großer Teil des von uAUG abgeleiteten uTREM2 wird vom Proteasom abgebaut. Die verbleibende uTREM2-Fraktion wird glykosyliert und gespalten, um dTREM2 (TREM2-Protein-Isoform ab stromabwärts gelegenem AUG) zu produzieren.

In dieser Studie haben wir einen repressiven regulatorischen Effekt auf die Translation von menschlichem TREM2 gezeigt, der durch seine 5′-UTR vermittelt wird. Wir haben auch die Beteiligung der 5′-UTR an der Reaktion auf Aminosäuremangel gezeigt. Da diese Merkmale von uAUG abhängen, das von einigen Primaten gemeinsam genutzt wird, heben unsere Ergebnisse die artspezifischen Merkmale von TREM2 hervor. Wir fanden heraus, dass die uAUG-vermittelte Regulation der TREM2-Translation bei einigen Primaten konserviert ist, bei Mäusen jedoch nicht (Abb. 1). Obwohl erwartet wird, dass die TREM2-Proteine ​​von Mensch und Maus konservierte Funktionen haben, ist es wahrscheinlich, dass diese beiden Proteine ​​unterschiedlichen Regulierungsmechanismen unterliegen. Beispielsweise haben wir kürzlich berichtet, dass TREM2 das alternative Spleißen von Exon 342 durchläuft. Ein Einzelkern-Transkriptom zeigte sowohl konservierte als auch nicht-konservierte Reaktionen zwischen Mikroglia von Mensch und Maus im Kontext von AD43. Somit könnten unsere Erkenntnisse zum Verständnis der artspezifischen Aspekte von Mikroglia beitragen. Kürzlich wurde über eine Hochregulierung der Trem2-Translation in einem Mausmodell von AD berichtet44. Da uAUG von TREM2, das die dTREM2-Translation unterdrückt, im Maus-Trem2 fehlt, kann die Aktivierung der Trem2-Translation in den AD-Modellmäusen über einen anderen Mechanismus als den von uns beschriebenen erfolgen. Weitere Untersuchungen sind erforderlich, um die Bedeutung dieser Befunde bei AD-Patienten zu bestimmen. Unsere Mutationsanalysen legten auch nahe, dass die kontinuierliche Translation von uAUG durch dAUG an der Unterdrückung der dTREM2-Expression beteiligt ist (Abb. 4), was als Konkurrenz zwischen uAUG und dAUG um die Translationsinitiierung interpretiert werden kann. Wir fanden auch heraus, dass die dTREM2-Spiegel durch Aminosäuremangel und Poly(I:C)-Behandlung abhängig vom uAUG reduziert werden (Abb. 5), was auf die Beteiligung zusätzlicher Determinanten hindeutet45. Die Verwendung von dAUG kann bei Vorhandensein von uAUG durch mehrere Faktoren eingeschränkt sein, darunter Störungen beim ribosomalen Scannen, die durch die Translationsinitiierung am uAUG, die Sekundärstruktur des 5′-UTR und transaktive Faktoren, die an das 5′-UTR binden, vermittelt werden. -UTR46. Die Aufklärung des genauen Mechanismus der 5′-UTR-vermittelten Repression würde eine Strategie zur Modulation der Expression von TREM2 liefern.

Zusätzlich zur translationalen Repression ist der TREM2 5′-UTR auch an der Expression von uTREM2 beteiligt. Die 30-Reste-Erweiterung am N-Terminus von uTREM2 erhöht die Länge des Signalpeptids. Unerwarteterweise beobachteten wir eine Proteinbande von dTREM2 zusammen mit der von uTREM2 in 5′-UTR-Md-Zellen (Abb. 4b). Beide Banden verschwanden, als ein Stoppcodon stromabwärts des uAUG eingeführt wurde (Abb. 4b). Wir schlagen vor, dass die N-terminale Region von uTREM2 an derselben Stelle wie das Signalpeptid von dTREM2 gespalten wird, was zur Produktion von dTREM2 führt. Die N-terminale Verlängerung von uTREM2 verlängert das Signalpeptid von 18 auf 48 Aminosäuren. Obwohl die durchschnittliche Länge von Signalpeptiden in Eukaryoten 22 Reste beträgt47, haben mehrere Gene ein langes Signalpeptid mit 40 oder mehr Resten48. Bemerkenswerterweise konnten wir bei Proteasom-Hemmung eine Proteinbande nachweisen, die an deglykosyliertes uTREM2 erinnert, insbesondere in den 5'-UTR-WT- und 5-UTR-Md-Zellen (Abb. 6a, ergänzende Abb. 9). Wir spekulieren, dass ein Großteil von uTREM2 durch Proteasomen schnell abgebaut wird und dass der verbleibende Anteil glykosyliert und gespalten wird, um dTREM2 zu produzieren (Abb. 6c). Es gibt ein weiteres Beispiel für ein glykosyliertes Membranprotein (US11), das aufgrund seiner verzögerten Spaltung sein Signalpeptid behält49. Das lange Signalpeptid in uTREM2 könnte zu einem bevorzugten proteasomalen Abbau von uTREM2 und einer verzögerten Spaltung des Signalpeptids geführt haben. Obwohl uTREM2 als Zwischenprodukt eines alternativen Wegs der dTREM2-Produktion oder als Nebenprodukt der uAUG-vermittelten Unterdrückung von dTREM2 angesehen werden könnte, sind weitere Studien erforderlich, um seine Funktionalität zu bestimmen.

Zusammenfassend zeigte diese Studie die Rolle des 5′-UTR bei der Translation von menschlichem TREM2 auf. Da der uAUG-vermittelte Regulationsmechanismus von TREM2 bei Mäusen nicht konserviert ist, unterstreicht unsere Studie die Bedeutung von Studien mit menschlichen Zellen, um neue Erkenntnisse über TREM2-bedingte Störungen zu gewinnen. Auch die Regulation von TREM2 auf der Translationsebene ist wichtig, was bei Transkriptomanalysen möglicherweise übersehen wird.

Die in dieser Studie verwendeten Primer sind in der Ergänzungstabelle 2 aufgeführt. Alle manipulierten Plasmide wurden einer DNA-Sequenzierung unterzogen.

Die 5′-UTR von Schimpansen, Krallenaffen und Mäusen wurde aus der genomischen DNA (erhalten aus HSP-239, HSCj-11050 bzw. 91062702) unter Verwendung spezifischer Primer amplifiziert. Fragmente des 5'-UTR und des menschlichen TREM2-CDS42 wurden durch PCR kombiniert, mit BamHI und XbaI verdaut und in die BamHI-XbaI-Stelle von pcDNA3.1 Hygro (+) (Invitrogen) kloniert.

Eine Reihe von 5'-UTR-Sequenzen von menschlichem TREM2 mit einem mutierten uAUG und/oder dAUG wurde wie zuvor beschrieben in das fl-TREM2-Minigen fusioniert51. Um die 5'-UTR mit oder ohne Mutation in uAUG und/oder dAUG zu erhalten, wurden das 5'-UTR-fusionierte TREM2-CDS und das fl-TREM2-Minigen als PCR-Vorlagen verwendet, um die Region von der 5'-UTR bis zur zu amplifizieren Mitte von Intron 1. Der Austausch von ATG durch GTG wurde dann mithilfe von PCR-Primern durchgeführt. Diese beiden Fragmente wurden durch PCR-vermittelte Amplifikation kombiniert, mit NheI und HindIII verdaut und in die NheI-HindIII-Stelle des fl-TREM2-Minigens kloniert.

F6X- und C23X-Substitutionen (Restzahlen wurden aus der uAUG gezählt) und eine Frameshifting-Insertion eines einzelnen Nukleotids wurden durch PCR unter Verwendung von Primern eingeführt, die die entsprechende Mutation enthielten. Jedes Fragment wurde mit NheI und HindIII verdaut und dann in die NheI-HindIII-Stelle des fl-TREM2-Minigens kloniert, das die 5'-UTR von TREM2 enthält. Die PCR zur Plasmidkonstruktion wurde unter Verwendung von KOD plus neo (TOYOBO) durchgeführt.

HEK293- und HeLa-Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM, Thermo Fisher Scientific), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (Sigma) und Penicillin/Streptomycin (Wako), bei 37 °C mit 5 % CO2 gehalten. Die von Callithrix jacchus abgeleitete HSCj-110-Zelllinie (JCRB1655), die vom Menschen abgeleitete THP-1-Linie und die von Pan troglodytes abgeleitete HSP-239-Zelllinie (JCRB1165) wurden von JCRB50 erhalten und in RPMI 1640-Medium gehalten ( GlutaMAX-Ergänzung, Thermo Fisher Scientific), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum und Penicillin/Streptomycin bei 37 °C mit 5 % CO2. Eine stabile Zelllinie, die das fl-TREM2-Minigen ohne 5′-UTR (5′-UTR-none) exprimiert, wurde bereits etabliert51. Zelllinien, die stabil fl-TREM2-Minigene (5′-UTR-WT, Mu, Md und Mud) exprimieren, wurden unter Verwendung des Flp-In-Systems etabliert, wie in unserer vorherigen Studie beschrieben. Die Integration von fl-TREM2-Minigenen wurde durch PCR unter Verwendung fragmentspezifischer Primer bestätigt.

Die Zellen wurden unter den folgenden Bedingungen behandelt: DMEM (hohe Glucose) mit Natriumpyruvat, ohne Aminosäuren (Wako) für 4 Stunden, 100 nM Bafilomycin (Merck) für 4 Stunden, 10 μM MG132 (Sigma) für 12 Stunden, 2 μg ml −1 Poly(I:C) (Tocris Bioscience) für 24 Stunden unter Verwendung von Lipofectamine RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific) und 1 μg mL−1 LPS (Sigma) für 6 Stunden. HEK293-Zellen wurden vor dem Tag der Plasmid-DNA-Transfektion auf Platten mit 12 Vertiefungen ausgesät. Typischerweise wurden 0,5 μg Plasmid mit Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher Scientific) in HEK293-Zellen transfiziert und 48 Stunden nach der Plasmidtransfektion geerntet. Für die Transfektion der Plasmide in HeLa-Zellen wurde Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific) verwendet.

Die gesamte RNA-Reinigung und die quantitative Analyse wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt52. Als Referenzgen wurde ACTB verwendet.

Zellfraktionierung und Western Blot wurden wie in früheren Studien durchgeführt42. Blotting-Bilder wurden mit einem Luminograph III (ATTO) aufgenommen. Die Signalintensitäten wurden mit der Fiji-Software (NIH) analysiert. Wie in Abb. 5 gezeigt, wurde die Membran mit Ponceau S-Lösung gefärbt, um das Gesamtprotein vor der Blockierung und Antikörperbehandlung zu messen. Die für das Western Blot verwendeten Antikörper sind in der Ergänzungstabelle 3 aufgeführt. Die vollständigen Blot-Bilder sind in der Ergänzungstabelle 10 dargestellt.

Die Proteinidentifizierung wurde wie zuvor beschrieben53 mit geringfügigen Änderungen durchgeführt. Kurz gesagt, Immunpräzipitationsproben wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und die Gele wurden mit dem Silver Stain MS Kit (Wako) gefärbt. Proteinbanden wurden aus dem Gel herausgeschnitten und mit einer Entfärbungslösung entfärbt. Anschließend wurde das Gel mit 25 mM Dithiothreitol reduziert und mit 1 % (w/v) Iodacetamid in 25 mM Ammoniumbicarbonat alkyliert. Jedes Gel wurde über Nacht bei 37 °C in Verdauungspuffer [50 mM Ammoniumbicarbonat, 0,01 % (w/v) ProteaseMax Surfactant (Promega), 1,33 μg ml-1 Trypsin (Promega) und 1,33 μg ml-1 Lysyl-Endopeptidase ( Wako)], und der Überstand wurde aufbewahrt. Peptide wurden aus den herausgeschnittenen Gelanteilen mit 2,5 % Trifluoressigsäure nach 15-minütigem Schütteln extrahiert. Nach der Verdauung wurden die resultierenden Peptide entsalzt und unter Verwendung von StageTips (Thermo Fisher) konzentriert. Das Gradientenprogramm mit den mobilen Phasen A und B (Acetonitril mit 0,1 % Ameisensäure) hatte die folgende Reihenfolge: 0 % B (0 Min.) – 30 % B (50 Min.) – 100 % B (51 Min.) – 100 % B ( 60 Minuten). LC-MS/MS-Daten wurden mit Proteome Discoverer Version 2.4 (Thermo Fisher Scientific) verarbeitet. Wir haben die Aminosäuresequenz von uTREM2 zur Uniprot-Datenbank hinzugefügt (Version 04/2017, mit 20.198 Sequenzen).

Die Immunfluoreszenz wurde gemäß den in unserer vorherigen Studie beschriebenen Methoden durchgeführt42. Kurz gesagt, HeLa-Zellen und stabile HEK Flp-In-Zelllinien wurden in Kammerobjektträgern mit acht Vertiefungen (WATSON) kultiviert. Die Zellen wurden 10 Minuten lang mit 4 % Paraformaldehyd (Wako) fixiert und 5 Minuten lang mit 0,1 % Triton behandelt. Nach 3-stündiger Inkubation mit Anti-TREM2-C-Term-Antikörper wurden die Zellen mit Alexa Fluor 488 Ziegen-Anti-Kaninchen-Ig (H + L) oder Alexa Fluor 568 Esel-Anti-Kaninchen-IgG (H + L) (Thermo Fisher Scientific) behandelt ) für 1 Stunde. Die Zellen wurden mit Vectashield-Eindeckmedium mit DAPI (VECTOR LABORATORIES) montiert. Zellbilder wurden mittels konfokaler Mikroskopie (LSM710; Carl Zeiss) erhalten.

Zur Immunpräzipitation wurde ein Ziegen-Anti-Human-TREM2-Antikörper (R&D, AF1828) mit Protein G-konjugierten Magnetkügelchen (Thermo Fisher Scientific) gemischt. Die Zellen wurden in 0,1 % Triton-X in PBS mit 1× Proteaseinhibitor (Roche) lysiert, gefolgt von einer 30-minütigen Rotation bei 4 °C. Nach der Zentrifugation (16.000 × g bei 4 °C für 10 Minuten) wurde der Überstand mit Protein G-konjugierten Magnetkügelchen bei 4 °C für 2 Stunden vorgeklärt und mit Magnetkügelchen, die mit einem Anti-TREM2-Antikörper oder einer Isotypkontrolle konjugiert waren, immunpräzipitiert durch Rotieren über Nacht bei 4 °C. Die Perlen wurden dreimal mit 0,1 % Triton-X in PBS gewaschen. Immunpräzipitate wurden von den Perlen in 0,1 M Gly-HCl-Puffer (pH 2,5, enthaltend 0,15 mM NaCl) eluiert. Als primärer Antikörper für das Western Blot wurde ein Kaninchen-Anti-TREM2-Antikörper (CST, D8I4C) verwendet. Als Sekundärantikörper wurde TrueBlot Anti-IgG HRP (ROCKLAND) verwendet.

Die immunpräzipitierten Produkte mit Anti-TREM2-Antikörpern wurden einer Deglykosylierung mit PNGase F (NEB) gemäß den Anweisungen des Herstellers unterzogen.

Für die statistische Analyse wurde die Software EXCEL Toukei (ESUMI Co., Ltd.) verwendet. Alle Diagramme wurden mit R-Software (Version 3.6.1, https://www.r-project.org/) erstellt. Die Stichprobengrößen sind in den Legenden der Abbildungen definiert. Die Messungen wurden an unterschiedlichen biologischen Replikaten durchgeführt, die unabhängige Transfektionen oder Zellbehandlungen darstellen. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung (SD) dar. Alle statistischen Tests waren zweiseitig und werden in den Legenden der Abbildungen beschrieben.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Quelldaten sind in den Zusatzdaten 1 verfügbar. Vollständige Blots sind in den Zusatzinformationen aufgeführt. Alle weiteren Daten sind auf Anfrage bei den entsprechenden Autoren erhältlich.

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Wir danken Dr. Jun-ichi Satoh für die Betreuung und hilfreichen Kommentare und Frau Minako Sato, Frau Hazuki Goshima und Frau Yuka Oda für ihre technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse für wissenschaftliche Forschung vom Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie (MEXT) an YK (16K09683, 19K07982, 16K07043, 20K07876) und MY (19J15024, 21K20700) sowie von unterstützt das Dementia Drug Resource Development Center Project (DRC), MEXT, Japan (S1511016). MY wurde durch ein Grant-in-Aid für JSPS Fellows (Grant-Nummer JP19J15024) und ein Nagai Memorial Research Scholarship der Pharmaceutical Society of Japan unterstützt.

Abteilung für Bioinformatik und molekulare Neuropathologie, Meiji Pharmaceutical University, 2-522-1, Noshio, Kiyose-shi, Tokio, 204-8588, Japan

Motoaki Yanaizu, Haruka Adachi und Yoshihiro Kino

Abteilung für RNA-Pathobiologie und Therapeutik, Meiji Pharmaceutical University, 2-522-1, Noshio, Kiyose-shi, Tokio, 204-8588, Japan

Motoaki Yanaizu & Yoshihiro Kino

Abteilung für Biochemie, Meiji Pharmaceutical University, 2-522-1, Noshio, Kiyose-shi, Tokio, 204-8588, Japan

Makoto Araki & Kenji Kontani

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MY und YK konzipierten und gestalteten die Experimente und verfassten das Manuskript. MY und HA führten Experimente durch. MA und KK führten massenspektrometrische Verfahren durch. Alle Autoren haben das Manuskript genehmigt.

Korrespondenz mit Yoshihiro Kino.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt Dileep Kumar und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Gracjan Michlewski und Gene Chong.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Yanaizu, M., Adachi, H., Araki, M. et al. Translationsregulation und Proteinkodierungskapazität der 5′-untranslatierten Region von menschlichem TREM2. Commun Biol 6, 616 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04998-6

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Eingegangen: 08. September 2022

Angenommen: 30. Mai 2023

Veröffentlicht: 08. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04998-6

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