Bevorzugte Kaninchen-Antikörperreaktionen gegen C

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 9156 (2023) Diesen Artikel zitieren

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In peptidimmunisierten Kaninchen gezüchtete Antikörper werden seit Jahrzehnten in der biologischen Forschung eingesetzt. Obwohl dieser Ansatz weit verbreitet ist, ist es aus mehreren Gründen gelegentlich schwierig, bestimmte Proteine gezielt anzusprechen. Eine Überlegung, die bei Mäusen festgestellt wurde, ist, dass humorale Reaktionen vorzugsweise auf den Carboxylterminus der Peptidsequenz abzielen, der im intakten Protein nicht vorhanden ist. Um Aufschluss über die Häufigkeit bevorzugter Kaninchen-Antikörperreaktionen auf C-Termini von Peptidimmunogenen zu geben, präsentieren wir unsere Erfahrungen mit der Erzeugung von Kaninchen-Antikörpern gegen menschliches NOTCH3. Insgesamt wurden 23 Antikörper gegen 10 Peptidsequenzen von menschlichem NOTCH3 erzeugt. Bei über 70 % (16 von 23) dieser polyklonalen Antikörper wurde festgestellt, dass sie C-terminal bevorzugen: NOTCH3-Peptid-reaktive Antikörper zielen weitgehend auf die terminierende freie Carboxylgruppe des immunisierenden Peptids ab. Die Antikörper, die C-terminale Epitope bevorzugten, reagierten schwach oder gar nicht mit rekombinanten Zielsequenzen mit Verlängerung des C-Terminus, der die freie Carboxylgruppe der Immunogenstruktur eliminierte; Darüber hinaus zeigte jedes dieser Antiseren keine Antikörperreaktivität gegenüber Proteinen, die vor dem C-Terminus des Immunogens verkürzt waren. Bei immunzytochemischen Anwendungen dieser Anti-Peptid-Antikörper fanden wir in ähnlicher Weise eine Reaktivität gegenüber rekombinanten Zielen, die am besten an Zellen binden, die den freien C-Terminus der Immunisierungssequenz exprimieren. Insgesamt zeigen unsere Erfahrungen eine starke Neigung von Kaninchen, Antikörperreaktionen auf C-terminale Epitope von NOTCH3-abgeleiteten Peptiden auszulösen, was voraussichtlich ihre Verwendung gegen das native Protein einschränken wird. Wir diskutieren einige mögliche Ansätze zur Überwindung dieser Tendenz, die die Effizienz der Antikörpererzeugung in diesem häufig verwendeten experimentellen Paradigma verbessern könnten.

Die Entwicklung und Anwendung von Forschungsantikörpern ist für die Untersuchung von Proteinen unverzichtbar. Unter den Forschungsantikörpern erfreuen sich Antipeptid-Antiseren großer Beliebtheit, vor allem aufgrund der Aufklärung einer großen Anzahl proteinkodierender Gensequenzen und technologischer Fortschritte bei der Peptidsynthese. Diese Fortschritte ermöglichen die in der Regel problemlose Herstellung von Antiseren durch Immunisierung von Tieren, ohne dass Proteinziele hergestellt oder gereinigt werden müssen1,2.

Obwohl die Anti-Peptid-Immunisierung größtenteils erfolgreich ist, gelingt es manchmal nicht, Antikörper zu erzeugen, die für den Nachweis von Proteinzielen nützlich sind1,3. Fehler wurden auf die Unfähigkeit des Peptidantigens zurückgeführt, die gleiche Konformation wie das Zielprotein anzunehmen4, auf das Vergraben der Zielsequenz in unzugänglichen Regionen5 oder auf eine posttranslationale Modifikation des Zielproteins, die sich nicht im Peptidimmunogen widerspiegelt.

In einer früheren Studie haben Liang und Kollegen6 einen weiteren möglichen Grund dafür festgestellt, dass es nicht gelingt, verwendbare Anti-Peptid-Antikörper zu erzeugen: die bevorzugte Ausrichtung von Antikörpern auf den Carboxyl-Terminus (C-Terminus) immunisierender Peptide, der im intakten Protein nicht vorhanden ist. Sie berichteten, dass die Immunisierung von Mäusen mit einem internen Epitop von C-CAM1 eine Antikörperantwort hauptsächlich gegen das C-terminale Ende des immunisierenden Peptids hervorrief; Monoklonale Antikörper der Mäuse reagierten auf das immunisierende Peptid in einer vom C-Terminus des Immunogens abhängigen Weise, diese Antikörper banden jedoch nicht an das intakte Protein. Die Forscher kamen zu dem Schluss, dass von der Maus stammende monoklonale Antikörper die im C-Terminus vorhandene Carboxylateinheit benötigen, die durch die im intakten Protein vorhandene Peptidbindung eliminiert wird.

In einer anderen Studie entwickelten Edwards und Kollegen7 einen erfolgreichen Ansatz zur Erzeugung von Antikörpern gegen bakterielle Proteine, der auf der Immunisierung von Kaninchen mit kleinen Peptiden beruhte, die den C-Termini einzelner Proteine entsprechen. Diese Studie zeigte, dass Kaninchen in der Lage waren, wirksame Reaktionen auf C-Termini von Peptiden zu erzeugen, und dass die gegen kurze Immunogene erzeugten Antiseren bemerkenswert spezifisch waren. Der relative Anteil der Antikörper, die die C-Termini der Peptidimmunogene bevorzugten, war bei mehreren gemeldeten Antikörpern hoch, wie durch Peptidkompetition von ELISA-Assays ermittelt.

In der aktuellen Studie fragen wir ab: (1) das Ausmaß, in dem anti-peptidische humorale Reaktionen bevorzugt auf den C-Terminus immunisierender menschlicher Peptidsequenzen in einzelnen Kaninchen abzielen, und (2) die Häufigkeit C-terminal bevorzugter humoraler Reaktionen in einer Reihe von Kaninchen, die mit Peptiden immunisiert wurden, die Fragmente eines menschlichen Proteins darstellen. Um diese Fragen zu beantworten, haben wir retrospektiv polyklonale Antiseren aus einer Reihe von Projekten analysiert, die darauf abzielten, NOTCH3-Antikörper zu erzeugen, wobei wir uns auf die Spezifität jedes Antikörperpräparats für den C-Terminus des zur Immunisierung verwendeten Peptids konzentrierten.

NOTCH3 ist ein Transmembranrezeptor (Abb. 1A), der mehrere Rollen in der Entwicklung, Homöostase und Pathologie spielt. Mutationen in NOTCH3 sind für die häufigste Ursache für erblichen Schlaganfall und vaskuläre Demenz, zerebrale autosomal-dominante Arteriopathie mit subkortikalen Infarkten und Leukoenzephalopathie (CADASIL) verantwortlich8,9.

Erzeugung und Charakterisierung von Anti-Peptid-Antikörpern gegen NOTCH3. (A) Positionen von NOTCH3-Sequenzen, die auf die Antikörperproduktion und Peptidimmunogene abzielen. Oben zeigt eine schematische Darstellung des menschlichen NOTCH3-Proteins, das größtenteils aus Tandem-EGF-ähnlichen Wiederholungen am N-Terminus besteht. Kreise zeigen die Positionen von Peptidsequenzen, die zur Immunisierung von Kaninchen verwendet werden. Die entsprechenden Peptidsequenzen, EGF-Wiederholungsorte (EGF#) und Antikörpernummern werden unten angezeigt. Es wurden Wildtyp-Sequenzen verwendet, mit Ausnahme von zwei Peptiden (entsprechend den Antikörpern 2076–2079), die CADASIL-Mutantenreste enthalten (in Rot). (B) Charakterisierungsstrategie zur Bestimmung der Zielpräferenz-Antiseren. Eine detaillierte Erläuterung der Charakterisierung der Antikörper 1495 und 1496 gegen eine Peptidsequenz von EGF27 veranschaulicht den Ansatz zur Bestimmung der Sequenzspezifität aller Antikörper. Die Immunogensequenz (grün) wurde in den C-Terminus von EGFP (GFP) kloniert, um die Expression von 5 rekombinanten Varianten zu steuern. Klon 0 endet genau am C-Terminus des Immunogens. Klon − 2 ist eine Deletion von zwei Aminosäuren aus Klon 0; Klon − 1 ist eine Deletion einer Aminosäure aus Klon 0; Klon + 1 enthält eine Aminosäureverlängerung zu Klon 0 (von der Wildtyp-Sequenz); und Klon + 2 enthält zwei zu Klon 0 hinzugefügte Aminosäuren. Alle 5 Rekombinanten und ein EGFP-Klon ohne NOTCH3-Sequenzen wurden in HEK293-Zellen exprimiert und rekombinante Proteine wurden durch Immunblotting (IB; siehe Abb. 2, 3) und durch Immunzytochemie (ICC; siehe Abb. 5) unter Verwendung der entsprechenden Antikörper analysiert.

Im Verlauf unserer Arbeit an NOTCH3 haben wir entdeckt, dass NOTCH3 an zwei Asp-Pro-Sequenzen in der Nähe des N-Terminus gespalten wird, was in CADASIL10,11 verstärkt ist. Diese Erkenntnisse erforderten die Erzeugung von Neo-Epitop-spezifischen monoklonalen Antikörpern, die spezifisch für C-terminale Asparaginsäurereste waren, die durch Asp-Pro-Spaltung erzeugt werden. Diese Antikörper sind spezifisch für Sequenzen mit C-terminaler Asparaginsäure; Die Verlängerung des Proteins über die terminalen Aspartatreste hinaus eliminierte die Bindung10,11.

Während dieser Studien stellten wir auch fest, dass die polyklonalen Seren von immunisierten Kaninchen, die zur Erzeugung der Antikörper gegen die terminalen Aspartatsequenzen verwendet wurden, stark mit Antikörpern angereichert waren, die das C-terminale Aspartat erfordern; Seren enthielten nur geringe Mengen an Antikörpern, die mit Sequenzen reagieren konnten, die den C-terminalen Aspartatrest nicht enthielten. (Die Daten werden als Teil dieser Studie gezeigt.) Dies veranlasste uns, die aktuelle Studie durchzuführen, um die Häufigkeit von Antikörperreaktionen zu bestimmen, die bevorzugt C-terminale Sequenzen aus einer großen Serie unabhängiger NOTCH3-Antikörper erkennen, die durch Peptidimmunisierung von Kaninchen hergestellt wurden .

Die Regionen von NOTCH3, auf die wir für die Antikörperproduktion abzielten, sind in Abb. 1A dargestellt. Die Antikörper zielen alle auf die Ektodomäne des Proteins ab, die Region, in der sich die meisten CADASIL-Mutationen befinden und die aus Tandem-EGF-ähnlichen Wiederholungen besteht12,13. EGF-ähnliche Wiederholungen sind mit Cysteinresten angereichert und alle Peptide enthalten mindestens einen Cysteinrest. Die verwendeten Peptidsequenzen sind in Abb. 1B dargestellt. Mit Peptiden wurden jeweils zwei bis vier Kaninchen immunisiert. Verschiedene Anbieter führten die Experimente durch10,11,14 und Immunisierungen wurden mit KLH-konjugierten Peptiden durchgeführt, deren Reinheit durch Massenspektroskopie verifiziert wurde.

Kaninchen wurden gemäß den Zeitplänen immunisiert, die von dem mit der Herstellung der Antikörper beauftragten Lieferanten standardisiert wurden. In allen Fällen zeigten die Seren vor der Immunisierung eine minimale Reaktivität gegenüber Immunogenen und am Ende des Immunisierungsplans produzierte jedes Tier ein Serum, das im ELISA bei einer Verdünnung von mehr als 1:512.000 positiv war, was auf eine starke humorale Reaktion auf die Immunisierung hinweist.

Die Seren wurden mithilfe von Säulen, die durch die Vernetzung von Peptiden mit Perlen erzeugt wurden, affinitätsgereinigt. Es wurden Standardmethoden verwendet, einschließlich Waschen mit Medien und Elution mit Säurepuffer, der dann gegen neutrales PBS dialysiert wurde, bevor die Antikörperpräparate nach Stabilisierung mit 20 % Glycerin eingefroren wurden. Die Reaktivität der endgültigen polyklonalen Antikörperpräparate wurde durch ELISA überprüft.

Die Spezifität jeder NOTCH3-Antikörper-Zielsequenz wurde durch Untersuchung von Immunblots von rekombinantem GFP, fusioniert mit Peptidsequenzen unterschiedlicher Länge, bestimmt; Wir veranschaulichen die Strategie anhand eines Beispiels in Abb. 1B. Genetische Klone von GFP wurden mit DNA-Sequenzen fusioniert, die die Aminosäuresequenz jedes immunisierenden Peptids kodieren (für jeden Antikörper Klon 0 genannt). Eine oder zwei Aminosäuren wurden aus dem Peptidziel entfernt, um die Klone −1 und −2 zu erzeugen. Zusätzlich wurden eine oder zwei Aminosäuren der NOTCH3-Proteinsequenz hinzugefügt, um die Klone +1 und +2 zu erzeugen. Ein Beispiel für erzeugte GFP-Klone Die Testsequenzziele der Antikörper 1495 und 1496 sind in Abb. 1B dargestellt. Die cDNA-Expressionsklone −2, −1, 0, +1 und +2 wurden in Zellen transfiziert, um Proteinlysate zu erzeugen, die Fusions-GFP-Proteine enthielten, und auf Western Blots aufgetrennt. Die Blots wurden mit NOTCH3-Antiseren und GFP-Antikörpern sondiert. Anschließend wurde das Verhältnis von NOTCH3-Antikörpersignal zu GFP als Maß für die NOTCH3-Antikörperaffinität herangezogen. Wenn Antikörper bevorzugt gegen den C-Terminus des immunisierenden Peptids reagieren, wird man das höchste Bindungssignal für das GFP-Fusionsprotein von Klon 0 beobachten, mit niedrigeren Signalen für die GFP-Fusionsproteine von den Klonen −2, −1, +1 und + 2.

Die Immunblot-Analyse mit NOTCH3-Antikörpern ist in den Abbildungen dargestellt. 2, 3 und ergänzende Abbildungen. 1, 2. Ein großer Teil der Antikörper reagierte mit Proteinen, die den Carboxylterminus des immunisierenden Peptids enthalten, wobei eine viel geringere Menge an Antikörpern an Proteine ohne Carboxylrest (Klone −2 und −1) und an Proteine mit Amino bindet Säureverlängerungen, die den Peptid-Carboxylrest blockieren (Klone +1 und +2).

Immunblot-Analyse der Zielpräferenz von NOTCH3-Anti-Peptid-Antikörpern. Dargestellt sind Immunblot-Analysen von Proteinlysaten von Zellen, die mit GFP-Fusionen mit variablen C-terminalen Resten transfiziert wurden (A–K). Für jeden dieser Blots wurde HEK293 mit 6 Plasmiden transfiziert, die die Expression von EGFP ohne NOTCH3-Sequenzen (GFP) oder mit einer vollständigen Immunogensequenz (Klon 0) oder Deletionen (–2 und –1) oder Additionen (+1 oder +2) steuern. (siehe Abb. 1B), die dem aufgeführten Antikörper entsprechen (siehe Antikörpernummer neben dem unteren Blot jeder Tafel). Die zur Immunisierung verwendeten Sequenzen sind mit Kreisen entsprechend Abb. 1A kodiert. Die Blots wurden sowohl auf GFP (oberer Blot) als auch auf NOTCH3-Antikörper (unterer Blot) untersucht und das Verhältnis des unteren/oberen Signals wurde bestimmt. Alle Werte wurden auf GFP normalisiert. Es wurden zwei verschiedene GFP-Kontrollen verwendet, die unterschiedlich große Nicht-NOTCH3-C-terminale Erweiterungen enthielten. (L) Eine schematische Darstellung der durch Transfektion hergestellten Proteine, die zeigt, dass Klon 0 für jede Zielsequenz das verwendete Immunogen enthält (endet in einem durch die rote Raute dargestellten Rest), während andere Klone Deletionen oder Erweiterungen enthalten (lila und blaue Rauten). Klon 0 in jedem Panel erzeugt das stärkste Signal, wenn ein Antikörper bevorzugt auf den C-Terminus des Immunogens abzielt. Immunoblot-Experimente wurden für jeden Antikörper mindestens dreimal durchgeführt. Die Signifikanz mit p < 0,05 im Vergleich zu Klon 0 wird durch ein schwarzes Sternchen (einfaktorielle ANOVA für normale Daten) und ein rotes Sternchen (Kruskal-Wallis-Test für nichtparametrische Daten) angezeigt. Gele in voller Länge sind in den ergänzenden Abbildungen dargestellt. 3, 4.

Zusätzliche Immunoblot-Analyse der Zielpräferenz von NOTCH3-Anti-Peptid-Antikörpern. Bitte beachten Sie Abb. 2; Weitere Antikörper wurden auf die gleiche Weise in (A–L) bewertet. Wie zuvor wurden die Experimente für jeden Antikörper mindestens dreimal durchgeführt. Gele in voller Länge sind in den ergänzenden Abbildungen dargestellt. 3, 4. Die Signifikanz mit p < 0,05 im Vergleich zu Klon 0 wird durch ein schwarzes Sternchen (einfaktorielle ANOVA für normale Daten) und ein rotes Sternchen (Kruskal-Wallis-Test für nichtparametrische Daten) angezeigt.

Bemerkenswert ist, dass es eine sehr starke Übereinstimmung der C-terminalen spezifischen Präferenz bei Antikörpern gab, die nach der Immunisierung mit einer bestimmten Peptidsequenz produziert wurden. Sequenzen, die C-terminale Präferenzen erzeugten, taten dies bei 100 % der immunisierten Kaninchen; Im Fall von EGF2C zeigten alle 6 Kaninchen qualitativ humorale Reaktionen, die auf C-terminale Epitope abzielten (Abb. 2H–K und 3A,B). Peptide, die Antikörper mit abgeschwächter C-terminaler Präferenz erzeugten, erzeugten bei jedem getesteten Kaninchen ähnliche Präferenzen (z. B. EGF1N (Abb. 2A, B) und EGF13 (Abb. 3E, F)). Die Übereinstimmung der C-terminalen Präferenz steht im Einklang mit der Erhaltung humoraler Reaktionen zwischen Individuen, die von der zur Immunisierung verwendeten Peptidsequenz abhängt.

Eine große Anzahl der zur Erzeugung von Antikörpern verwendeten Peptide endete mit Aspartatresten. Um zu verifizieren, dass die Antikörper außer dem terminalen Aspartat noch einzigartige Reste benötigten, führten wir ein Immunoblotting aller Proteine des Klons 0 durch, die mit Asparaginsäure endeten, wobei wir Antikörper verwendeten, die gegen C-terminale Asparaginsäuresequenzen gerichtet waren. Obwohl einige Antikörper eine sehr schwache Kreuzreaktivität gegen Epitope aufwiesen, die nicht zur Immunisierung verwendet wurden, waren neun von neun Antikörpern am stärksten von NOTCH3-Sequenzen betroffen, die zur Immunisierung verwendet wurden, wenn sie gegen Panels von GFP-NOTCH3-Fusionen getestet wurden. Abbildung 4 zeigt vier Antikörper, die für die Immunisierungssequenz in Immunoblots hochspezifisch waren.

Spezifität von Antikörpern, die bevorzugt auf den C-Terminus von NOTCH3-Peptiden abzielen. Eine Immunblot-Analyse mit den polyklonalen Antikörpern 5210 (A), 4944 (B), 1415 (C) und 1496 (D) wurde durchgeführt, um die Spezifität jedes Antikörpers gegen neun unabhängige NOTCH3-Sequenzen zu bestimmen. Die Identität jedes Proteins wird über den Spuren der Blots angezeigt; Spur 1 ist eine Nicht-NOTCH3-GFP-Negativkontrolle; andere Spuren repräsentieren Klon 0 aus den in Abb. 1 gezeigten Sequenzen (Markierungen wurden aus Gründen der Klarheit abgekürzt; siehe Abb. 1A, EGF#). Jedes Panel zeigt die Sondierung auf GFP (oberer Blot) im Vergleich zur Sondierung mit den NOTCH3-Antikörpern (unterer Blot jedes Paares). Gele in voller Länge sind in der ergänzenden Abbildung 5 dargestellt.

Wir haben auch die C-terminale Präferenz von NOTCH3-Antikörpern durch Zellfärbung für in Zellkultur exprimierte Proteine bewertet. Zellkulturen wurden mit den in den Abbildungen verwendeten Expressionskonstrukten transfiziert. 2, 3. Nach der Fixierung transfizierter Zellen führten wir eine Immunzytochemie mit verwandten Antikörpern durch. Von Antikörpern mit C-terminaler Präferenz wurde erwartet, dass sie eine starke Färbung von Zellen zeigen, die mit Klon 0, aber nicht mit den Klonen −2, −1, +1 oder +2 transfiziert waren. Im Allgemeinen gab es eine gute Übereinstimmung zwischen der durch Immunblotting ermittelten C-terminalen Präferenz und C-terminale Präferenz durch Immunzytochemie bewertet. Beispielsweise zeigen wir in Abb. 5 die Färbung der Antikörper 4143, 9932 und 1415 von Zellen, die mit einer Reihe von Klonen transfiziert wurden, die das Zielpeptid (Klon 0; Abb. 5) und Deletionen oder Hinzufügungen (Klone − 1 und + 1; Abb. 5). Die Zellfärbung war bei Klon 0 am stärksten und lag bei den Klonen − 1 oder + 1 nicht über dem Hintergrund. Dieses Muster stimmt mit den Reaktivitätspräferenzen durch Immunblotting überein. Es gab mehrere Antikörper, die sowohl bei nicht transfizierten Zellen als auch bei allen transfizierten Gruppen eine starke Hintergrundfärbung erzeugten, was dies unmöglich machte Beurteilung der C-terminalen Präferenz. Der Antikörper 8274 zeigte eine Färbung für Zellen, die die Klone − 1, 0 und + 1 exprimierten (Reihe 5; Abb. 5), was mit den Immunblot-Ergebnissen übereinstimmte und zeigte, dass dieser Antikörper eine nicht-exklusive C-terminale Bindung aufwies.

Standortpräferenzen von Anti-Peptid-NOCH3-Antikörpern durch immunzytochemische Analyse. HEK293-Zellen wurden vorübergehend mit rekombinanten Konstrukten transfiziert, die den Top-Markierungen entsprachen. Jeder Satz transfizierter Zellen wurde links mit Antikörpern gefärbt. GFP-Klon − 1 entspricht GFP, fusioniert mit der entsprechenden immunisierenden Peptidsequenz mit einer Aminosäuredeletion. GFP-Klon 0 ist die GFP-Fusion mit der Immunogensequenz (am C-Terminus mit der Peptidsequenz in Abb. 1A übereinstimmend). GFP-Clone + 1 enthält eine zusätzliche Aminosäure. Alle GFP-Rekombinanten mit NOTCH3-Sequenzen umfassen Sequenzen, die zur Immunisierung verwendet werden (wie in Abb. 1A gezeigt). Beispielsweise wurden mit 4143 untersuchte Zellen mit Konstrukten transfiziert, die auf Sequenzen von EGF2(C) enden: SCRCPRGFRGPDCSLP, SCRCPRGFRGPDCSLPD und SCRCPRGFRGPDCSLPDP.

Frühere Arbeiten zeigten, dass eine Tendenz zu humoralen Immunantworten bei Mäusen auf den C-Terminus von Peptiden die Vielfalt und den Nutzen von Antikörpern einschränken könnte6. Hier beschreiben wir die Ergebnisse einer Reihe von 23 Kaninchenimmunisierungen mit 10 verschiedenen Peptiden. Wir zeigen, dass eine große Mehrheit der Antiseren aus diesen Immunisierungen Antikörper erzeugen, die hauptsächlich auf die C-terminalen Sequenzen des Peptids reagieren, auf Kosten von Antikörpern, die vom C-Terminus des Immunogens unabhängig sind. Wir zeigen auch, dass die Präferenz für C-terminale Epitope bei einzelnen Kaninchen ähnlich ist und von der Peptidsequenz abhängt.

Dies ist unseres Wissens nach die größte Studie, die eine starke Präferenz für die humorale Reaktion bei Kaninchen auf gezielte C-Termini menschlicher Peptidsequenzen zeigt. Die Ergebnisse stimmen mit der Studie von Edwards überein, die eine sehr effektive Produktionsrate von Antikörpern gegen eine Klasse von Proteinen von Interesse berichtete, wenn C-terminale Peptidsequenzen zur Immunisierung verwendet wurden7. Frühere polyklonale Antikörper gegen Peptide mit der Endung Aspartat bestanden hauptsächlich aus Antikörpern, die gegen C-Termini der Peptidimmunogene reagierten, was den Nachweis von Caspase-generierten Neo-Epitopen ermöglichte15,16. Basierend auf der gemeinsamen Arbeit scheint es wahrscheinlich, dass ein Ansatz zur Herstellung von Reagenzien gegen Säugetierproteine die Voreingenommenheit des Immunsystems von Kaninchen nutzen könnte, um C-terminale Antikörper zu erzeugen.

Ein Anstieg der Anzahl monoklonaler Kaninchenantikörper, der durch die Verfügbarkeit schneller Arbeitsabläufe vorangetrieben wird, die die Antikörpererzeugung erleichtern, einschließlich Technologien zum Klonen von B-Zellen, unterstreicht die Bedeutung dieser Beobachtungen. Die Anzahl der Klone, die zur Generierung erfolgreicher Antikörper gescreent werden müssen, könnte hoch sein, wenn zur Impfung verwendete Peptide C-terminal spezifische Reaktionen hervorrufen. Es ist möglich, dass zukünftige monoklonale Kaninchenprojekte effizienter werden könnten, indem Antikörper gegen den nativen C-Terminus von Proteinen erzeugt werden, wie von Edwards et al.7 vorgeschlagen.

Können die Erkenntnisse verallgemeinert werden? Ein Faktor, der uns zuversichtlich macht, ist die Tatsache, dass wir mehrere Peptidsequenzen als Immunogene untersucht haben. Darüber hinaus stützte sich die Studie nicht auf die Nutzung einer einzigen Anlage zur Herstellung von Antikörpern; Die Antikörpererzeugung wurde an Parteien ausgelagert, die nicht an der Analyse der Seren beteiligt waren. Darüber hinaus wurde das Projekt über einen langen Zeitraum durchgeführt. Schließlich konnten wir die C-terminale Präferenz von Antikörpern in den meisten Fällen mit zwei verschiedenen Methoden bestätigen.

Dennoch ist es möglich, dass die beobachtete Präferenz für C-Termini überschätzt wird. Eine Einschränkung dieses Berichts ist sein retrospektiver Charakter, bei dem Seren analysiert wurden, die im Rahmen mehrerer unabhängiger Projekte gewonnen wurden, die nicht dazu gedacht waren, die Hypothese dieses Berichts zu testen. Die in dieser Studie verwendeten Peptide stammten alle von einem einzigen extrazellulären Protein. NOTCH3 ist möglicherweise weniger immunogen als andere Proteine, da es möglicherweise auf natürliche Weise zirkuliert17 und weil Säugetierhomologe gut konserviert sind. Tatsächlich sind die meisten zur Immunisierung verwendeten menschlichen Peptide nahezu identisch mit Kaninchensequenzen. Es gibt Unterschiede in einzelnen Resten bei den Peptiden, die für die Antikörper 2076–2079, 9931, 9932, 1412 und 1413 verwendet werden, und Unterschiede in zwei Aminosäuren bei den Antikörpern 1495–1496. Die verbleibende Hälfte der menschlichen Peptide ist identisch mit Kaninchensequenzen.

Als pragmatische Untersuchung führten wir keine Mutationsanalyse oder biochemische Modifikation von Peptiden durch, die genauere Details der C-terminalen Präferenz ermöglichen würden. Die für diese Studie ausgewählten Sequenzen waren nicht cysteinfrei, da NOTCH3 ein cysteinreiches Protein ist. Wir können die Möglichkeit nicht ausschließen, dass die C-terminale Präferenz durch den hohen Cysteingehalt von Peptiden gesteuert wird, der Proteine in spezifische Konformationen zwingen kann, die die humorale Reaktion beeinflussen. Zukünftige Studien mit einer erweiterten Untersuchung der C-terminalen Titer könnten in Betracht gezogen werden, insbesondere wenn sie von mehreren Forschern oder Herstellern von Antikörpern im industriellen Maßstab initiiert werden, die wahrscheinlich Daten in einem viel größeren Maßstab als diese Studie liefern werden. Eine solche Datenbank würde ein tieferes Verständnis spezifischer Kategorien von Sequenzen ermöglichen, die mit größerer Wahrscheinlichkeit C-terminale Reaktivität erzeugen.

Ungeachtet der Generalisierbarkeit ist es klar, dass es bei Kaninchen zu einer C-terminalen Präferenz von Antikörperreaktionen kommt; Dementsprechend kann eine Verringerung der relativen Menge an C-terminalen Antikörpern die Wirksamkeit der Antikörpererzeugung verbessern. In Zukunft können mehrere Methoden zur Blockierung des C-Terminus getestet werden, darunter (1) die Verwendung zyklischer Peptide; (2) chemische Blockierung des C-Terminus von Peptiden durch Veresterung; (3) Affinitätsreinigung unter Verwendung von Peptiden, die über den C-Terminus oder mit blockierten C-Termini konjugiert sind; (4) Strategien zur Verhinderung der Reaktivität von Cysteinresten, die möglicherweise immunogene Regionen verbergen, die für die Erkennung der Mitte von Peptiden wichtig sind; und (5) Verwendung alternativer Adjuvantien oder einer aggressiven Adjuvansdosierung, die dazu beitragen könnten, die Toleranz gegenüber konservierten Epitopen im Kern von Peptiden zu überwinden. Es ist zu beachten, dass Liang et al.6 den C-Terminus von C-CAM1-Sequenzen amidiert und nicht festgestellt haben, dass dies die Tendenz von Mäusen erhöht, Antikörper zu produzieren, die das intakte Zielprotein erkennen; Stattdessen schlugen sie ein Screening nach monoklonalen Antikörpern gegen ein längeres C-terminal verlängertes Peptid als Immunogen vor, gefolgt von der Verwendung eines kurzen Peptids zum Screening (oder in diesem Fall einer Affinitätsreinigung). Im Hinblick auf die Cystein-Alkylierung, um die chemische Vernetzung cysteinreicher Peptide zu blockieren, könnte dies versucht werden, aber seine Auswirkungen wurden nachweislich abgeschwächt, da alkylierte Cysteine selbst zum Ziel von Antikörperreaktionen werden können18,19. Ein natürlicher Ausgangspunkt zum Testen der Wirkung von Adjuvantien wäre die Verwendung von Alternativen zum vollständigen Freundschen Adjuvans, das für alle Tiere in dieser Studie verwendet wurde.

Wir kommen zu dem Schluss, dass die C-terminale Präferenz von Antikörperreaktionen ein gemeinsames Merkmal der Produktion von Anti-Peptid-Antikörpern sein könnte; Dies sollte als mögliche Ursache dafür in Betracht gezogen werden, dass keine Antikörper gegen native Proteinziele gebildet werden.

Polyklonale Kaninchenantikörper wurden von kommerziellen Anbietern unter Verwendung von Standardverfahren erzeugt, die an anderer Stelle detailliert beschrieben werden10,11,14. Alle Tierversuche wurden von den Institutional Animal Care and Use Committees (IACUC) von GenScript und Cocalico Biologics überprüft und genehmigt und in Übereinstimmung mit den relevanten Richtlinien und Vorschriften durchgeführt, einschließlich der Empfehlungen des Panel on Euthanasia der American Veterinary Medical Association und von ARRIVE Richtlinien (eine Kontrollgruppe nicht mit Peptiden immunisierter Tiere wurde nicht einbezogen, da dies für die Antikörperproduktion nicht erforderlich ist). Es wurden Peptidantigene synthetisiert, die den in Abb. 1 gezeigten Resten des menschlichen NOTCH3-Proteins entsprechen (Sequenzen aus Zugang: NP_000426.2 GI: 134244285). Die Antigene wurden vor der Immunisierung mit KLH vernetzt. Dies erfolgte mit vollständigem Freundschem Adjuvans für die Primärimmunisierung und mit unvollständigem Freundschem Adjuvans für nachfolgende Auffrischungsimpfungen. Alle Tiere, denen die beschriebenen Peptidantigene injiziert wurden, wurden in die Studie einbezogen. Testblutungen wurden von den Anbietern gemäß ihrem standardisierten Arbeitsablauf analysiert. In der aktuellen Studie wurde Serum aus Blutungen im Endstadium zur Beurteilung der Reaktivitätsprofile verwendet.

Doppelsträngige Oligonukleotide, die für Zielepitope kodieren, wurden durch Standardligationsverfahren mit pEGFP-C3 (Clontech) in den C-Terminus des offenen Leserahmens von EGFP eingefügt; Alle Konstrukte wurden sequenziert, um das Vorhandensein eines kontinuierlichen offenen Leserahmens zu bestätigen. Als Kontrollen wurden EGFP-C1 oder EGFP mit einer irrelevanten C-terminalen Verlängerung verwendet, um die Hintergrundreaktivität gegenüber dem EGFP-Protein zu messen. Durch die Verwendung von zwei Negativkontrollen wurden Produkte unterschiedlicher Größe erzeugt, die in verschiedenen Immunoblot-Panels zu sehen waren (z. B. Abb. 2A–H vs. Abb. 2I, K).

Wir verwendeten Methoden aus zuvor beschriebenen Arbeiten14,18. Proteine wurden auf SDS-Polyacrylamidgelen aufgetrennt; Anschließend wurden sie mit einem iBlot 2-Gerät (Invitrogen, Methode P0 20 V für 1 Minute/23 V für 4 Minuten/25 V für 2 Minuten) auf Nitrozellulose übertragen. Nitrozellulosemembranen wurden mit TBST mit 5 % Milch blockiert und anschließend mit Primärantikörpern in TBST über Nacht bei 4 °C sondiert. Die primären Antikörper wurden in einer 1:1000-Verdünnung aus affinitätsgereinigten Seren verwendet. Sekundärantikörper in TBST wurden 30 Minuten lang bei Raumtemperatur angewendet. Das Waschen nach der Antikörperinkubation erfolgte dreimal mit TBST bei Raumtemperatur. Zu den verwendeten Sekundärantikörperpräparaten gehörten Esel-Anti-Maus-IRDye 680RD (Li-Cor Nr. 926-68072, 1:10.000-Verdünnung, AB_10953628) und Ziegen-Anti-Kaninchen-IRDye 800CW (Li-Cor Nr. 926-32211, 1:10.000-Verdünnung, AB_2651127). . Zur Datenerfassung und Quantifizierung wurde ein Li-Cor Odyssey Imager mit Detektionseinstellungen bei 700 nm und 800 nm und der Software Li-Core Image Studio eingesetzt. Immunblots in voller Länge sind in den ergänzenden Abbildungen dargestellt. 3–5.

Kultivierte HEK293-Zellen wurden in DMEM und 10 % fötalem Rinderserum gezüchtet. An diesen Zellen wurde eine Immunzytochemie durchgeführt, nachdem sie mit EGFP-Plasmiden unter Verwendung von PolyJet (SignaGen, Kat.-Nr. SL100688) gemäß dem vom Hersteller empfohlenen Protokoll20 transfiziert wurden. Nach der Inkubation über Nacht wurden die Zellen mit Formalin fixiert. Die Zellen wurden 30 Minuten lang in Blockierungslösung (2 % BSA in PBS) inkubiert und Primärantikörper (1:200 für GFP-Antikörper und 1:500 für affinitätsgereinigte Seren) wurden 2–4 Stunden lang bei Raumtemperatur aufgetragen. Biotinylierte Sekundärantikörper in Blockierungslösung mit einer Verdünnung von 1:200 wurden 30 Minuten lang aufgetragen, gefolgt von einer 15-minütigen Inkubation der ABC-Lösung, die gemäß dem Protokoll des Herstellers hergestellt wurde (Vectastain Elite ABC-Kit, Vector Lab, Kat.-Nr. NC9293436). Abschließend erfolgte eine 1–5-minütige DAB-Inkubation für die Farbreaktion mit dem ImmPACT DAB HRP Substrate Kit (Vector Lab, Kat.-Nr. NC9567138); alle Waschschritte wurden drei- bis fünfmal mit PBS durchgeführt; Zellen wurden nicht gegengefärbt. Replikattransfektionen wurden auch auf GFP (sc-9996, Santa Cruz Biotechnology) gefärbt.

Datensätze wurden mithilfe des Shapiro-Wilk-Tests auf Normalität analysiert. Für normalverteilte Daten wurden Vergleiche unter Verwendung einer einfaktoriellen ANOVA mit dem Dunnet-Test für Mehrfachvergleiche durchgeführt. Für die nichtparametrische Analyse wurden Kruskal-Wallis-Tests gefolgt von Dunns mehrfacher Vergleichs-Post-hoc-Analyse verwendet, um die Unterschiede zwischen den Gruppen zu vergleichen (Analysesoftware Prism 8). Ein Wahrscheinlichkeitswert < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen.

Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Abteilung für Neurologie, University of Michigan, Ann Arbor, MI, 48109, USA

Soo Jung Lee, Mitchell B. Gasche, Connor J. Burrows, Akhil Kondepudi, Xiaojie Zhang und Michael M. Wang

Abteilung für molekulare und integrative Physiologie, University of Michigan, 7725 Medical Science Building II Box 5622, 1137 Catherine St., Ann Arbor, MI, 48109-5622, USA

Michael M. Wang

Neurologiedienst, Department of Veterans Affairs, VA Ann Arbor Healthcare System, Ann Arbor, MI, 48105, USA

Soo Jung Lee, Xiaojie Zhang und Michael M. Wang

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SJL entwarf die Studie, führte Experimente durch, analysierte die Daten, erstellte die Zahlen und überprüfte das Manuskript. MBG führte Experimente durch, analysierte die Daten, erstellte die Zahlen und überprüfte das Manuskript. CJB führte Experimente durch und überprüfte das Manuskript. AK führte Experimente durch und überprüfte das Manuskript. XJ analysierte die Daten und überprüfte das Manuskript. MMW hat die Studie entworfen, die Daten analysiert, die Zahlen aufbereitet und das Manuskript geschrieben.

Korrespondenz mit Michael M. Wang.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Lee, SJ, Gasche, MB, Burrows, CJ et al. Bevorzugte Kaninchen-Antikörperreaktionen auf C-Termini von NOTCH3-Peptidimmunogenen. Sci Rep 13, 9156 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36067-7

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Eingegangen: 3. Februar 2023

Angenommen: 29. Mai 2023

Veröffentlicht: 06. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36067-7

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